細胞縫隙連接在黃連素增強順鉑細胞毒性中的作用研究.pdf

1、研究背景： 腫瘤是威脅人類健康的主要疾病，目前化學(xué)治療仍然是中晚期癌癥患者的主要治療手段，但是現(xiàn)有的抗腫瘤藥物還不能滿足臨床治療的需要。因此，尋找高效、低毒的抗腫瘤藥物和輔助藥物是一迫切而長期的任務(wù)。順鉑(Cisplatin，CDDP)是目前最為有效的抗腫瘤藥物之一，屬于細胞周期非特異性藥物，具有抗瘤譜廣、對乏氧腫瘤細胞有效的特點[1]。該藥在臨床上廣泛用于頭頸部鱗狀細胞癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、淋巴肉瘤以及肺癌等惡性腫瘤的

2、治療，其中對非精原細胞性睪丸瘤最有效，它是多種腫瘤聯(lián)合化療方案的主要組成藥物。盡管順鉑自上個世紀70年代就開始用于臨床治療惡性腫瘤，但兩大因素制約了該藥的臨床應(yīng)用。一是腫瘤細胞對順鉑產(chǎn)生耐藥性(包括固有性耐藥和獲得性耐藥)，從而導(dǎo)致化療失敗，惡性腫瘤的治愈率和遠期生存率受到影響；二是順鉑在長期大劑量使用時可產(chǎn)生比較嚴重的不良反應(yīng)，如胃腸道反應(yīng)、骨髓抑制、耳毒性等。因此，尋找能有效防止腫瘤耐藥性產(chǎn)生和增加腫瘤對順鉑的敏感性，以降低順鉑用量

3、、減少不良反應(yīng)的方法，對提高順鉑的療效，擴大順鉑的應(yīng)用范圍具有重要的意義。 細胞縫隙連接(gap junction，GJ)是細胞之間的一種蛋白質(zhì)連接通道，廣泛存在于實質(zhì)性臟器(如心臟，肝臟，腎臟，中樞神經(jīng)，皮膚，肌肉等)組織中。GJ提供了一種細胞與細胞之間的直接聯(lián)系通道，是細胞之間信號傳遞的一種重要方式?，F(xiàn)已證明GJ在同步細胞的活動、維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、控制細胞的生長和發(fā)育等生命過程中發(fā)揮十分重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)：在多種腫瘤組織

4、和細胞中，GJ的功能降低或缺失；恢復(fù)或增強GJ功能，可增強多種抗腫瘤藥物(包括順鉑)的細胞毒性[2，3]。因此，尋找能夠增強腫瘤細胞GJ功能的藥物，將為防止腫瘤對順鉑耐藥性的產(chǎn)生，提高順鉑療效，降低其不良反應(yīng)提供一種有效的途徑。但是至今為止，尚未發(fā)現(xiàn)能特異改變GJ功能的藥物。 黃連素(berberine)是從毛茛科黃連屬植物根狀莖中提取的一種異喹啉生物堿，以往研究表明，它有抗原蟲和抗微生物的作用，臨床上長期用于清熱解毒、抗腸道細

5、菌感染[4]。近來的研究發(fā)現(xiàn)黃連素有增強腫瘤細胞對某些化療藥物和放療敏感性的作用。如Myung—Ja YOUN等[5]研究發(fā)現(xiàn)，用黃連素預(yù)處理HeLa細胞，能夠增強順鉑誘導(dǎo)細胞凋亡的作用；J.Liu等發(fā)現(xiàn)黃連素能增強雌激素受體抑制劑對乳腺癌細胞系的毒性[6]。但目前黃連素增強化療藥物對腫瘤細胞殺傷力的機理不明。 研究目的： 本研究在轉(zhuǎn)染并穩(wěn)定表達連接蛋白32和連接蛋白26(connexin32/connexin26，Cx

6、32/Cx26)的HeLa細胞，觀察黃連素對順鉑細胞毒性和GJ功能的影響；并探討黃連素是否可以通過改變GJ功能而增強順鉑細胞毒性。本研究將為闡明黃連素增強順鉑抗腫瘤作用的機理提供新的資料；為尋找更有效的防止腫瘤耐藥性產(chǎn)生，提高順鉑療效的方法提供新的思路。 實驗方法： 轉(zhuǎn)染并表達含Cx32/Cx26的HeLa細胞的培養(yǎng)、篩選及誘導(dǎo)：本實驗室構(gòu)建了能夠表達異質(zhì)性Cx32/Cx26通道的載體質(zhì)粒(PBI—Cx32T/Cx26)

7、[7]。這種雙向質(zhì)?？梢栽谝粋€啟動子的控制下同時表達Cx32和Cx26。Cx的表達是可以控制的，一般情況下，Cx不表達；需要表達時，在培養(yǎng)基中加入doxycycline引起Cx表達。這樣，能夠避免因過度表達Cx引起的細胞傷害。本研究采用轉(zhuǎn)染并穩(wěn)定表達Cx32/Cx26的HeLa細胞。 標準細胞集落形成分析法(Standard colony—forming assay)分析順鉑細胞毒性 本研究采用Dr.Glazer報道的“

8、標準細胞集落形成分析法”，測定順鉑對培養(yǎng)細胞(穩(wěn)定表達Cx32/Cx26的HeLa細胞)的細胞集落(克隆)形成的影響[2]。細胞集落形成反映了單個細胞增殖潛力，能較靈敏地測定抗癌藥的活性。本實驗以順鉑降低細胞集落形成率(Surviving Fraction)作為順鉑的細胞毒性指標。用不同密度接種細胞的方法獲得有GJ形成(已融合)的細胞和無GJ(未融合)的細胞。在上述細胞，觀察GJ形成對順鉑的細胞毒性影響。細胞集落形成率(Survivin

9、g Fraction)=順鉑處理組的細胞集落數(shù)/未用順鉑處理組的細胞集落數(shù) 為了避免不同生長期的細胞對順鉑敏感性的差異對實驗結(jié)果的影響，細胞在加入順鉑前24小時用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，使所有細胞均同步在G1期?！癙arachute assay”測定細胞之間熒光染料傳遞－檢測黃連素對培養(yǎng)細胞GJ功能的影響[7-9]。將表達有Cx32/Cx26的HeLa細胞與熒光指示劑Calcein—AM和Dil—CM共同孵育，使Calcein—AM和

10、Dil—CM進入細胞。培養(yǎng)4小時，待形成穩(wěn)定的GJ后，用顯微熒光系統(tǒng)觀察，計數(shù)一個“供體細胞”周圍含有Calcein的“接受細胞”作為GJ功能指標。 免疫印跡法(Western blotting)測定黃連素對Cx32/Cx26表達水平的影響：收集每組約5×105個細胞，提取細胞全蛋白，用DC蛋白分析試劑盒(美國Bio—Rad)和分光光度計繪制曲線并測定蛋白濃度。每孔取20μg蛋白，加上樣緩沖液在90℃溫度下變性5min，80V電

11、泳30min，使蛋白電泳至濃縮膠和分離膠交界處，再用100V電泳1h，使蛋白電泳至分離膠底部，蛋白電泳裝置完成10％SDS—PAGE電泳，用蛋白電轉(zhuǎn)移100V350 mA耗時90min將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上(美國Hybond)。5％脫脂牛奶封閉1h，與抗HA抗體(1:1500)(美國Zymed)、4℃搖床過夜孵育，TBST洗滌10min3次，再與羊抗鼠源IgG(1:15000)孵育1h，TBST洗滌5min3次，用增強型化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒

12、(ECL)(英國Amersham Intermational plc)放射自顯影于X線膠片上。 實驗結(jié)果： 1.順鉑(2.5μM)能夠顯著降低穩(wěn)定表達有Cx32/Cx26的HeLa細胞集落形成率。在有GJ形成的細胞(高密度接種，生長融合的細胞)，順鉑的細胞毒性顯著大于無GJ形成的細胞(低密度接種，細胞生長未融合)。在有GJ形成的細胞，用GJ抑制劑oleamide(25μM)和18-α—GA(10μM)可降低順鉑的細胞毒性

13、；而GJ功能增強劑全反式維甲酸(All—Trans—Retinoic Acid，RA)可顯著增加順鉑的細胞毒性。結(jié)果表明GJ形成和增強GJ功能可增強順鉑的細胞毒性；抑制GJ功能可降低順鉑的細胞毒性。 2.黃連素增強由Cx32/Cx26組成的GJ功能。“Parachute Assay”熒光傳遞實驗表明：黃連素(0.01-1μM)能濃度依賴性的增加表達Cx32/Cx26的HeLa細胞之間的熒光傳遞，表明黃連素能顯著增強GJ功能。

14、 3.黃連素增強Cx32/Cx26蛋白表達。Western blotting檢測的結(jié)果表明，黃連素(0.1-1μM)能上調(diào)doxcycline誘導(dǎo)的Cx32/Cx26蛋白表達水平。 4.采用Dr.Glazer報道的“標準細胞集落形成分析法”，測定黃連素對培養(yǎng)細胞(穩(wěn)定表達Cx32/Cx26的HeLa細胞)的細胞集落(克隆)形成的影響。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有無GJ形成的細胞，在黃連素實驗濃度范圍內(nèi)(0.001μM-1μM)，對表達C

15、x32/Cx26的HeLa細胞無毒性作用。 5.在有GJ形成的細胞，用黃連素(0.1μM)顯著增強順鉑的細胞毒性。在有GJ形成的細胞，用黃連素(0.1μM)預(yù)處理4小時后再用順鉑(5μM)處理1小時，細胞集落形成率顯著低于順鉑單用組；而在無GJ形成細胞，黃連素對順鉑的細胞毒性無影響。 結(jié)論： 1.GJ形成和GJ功能升高能夠顯著增強順鉑的細胞毒性；GJ功能減弱可降低順鉑的細胞毒性。 2.黃連素能增加Cx32