縫隙連接細(xì)胞間通訊在“自組裝”工程化軟骨構(gòu)建過程中的作用研究.pdf

1、目的：探討縫隙連接細(xì)胞間通訊在以生長分化因子5(GDF-5)誘導(dǎo)的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSCs)“自組裝”形成軟骨組織過程中的作用。
　　方法：體外培養(yǎng)hMSCs,貼壁細(xì)胞傳代,取第三代細(xì)胞,按兩種培養(yǎng)方式培養(yǎng)。一、單層培養(yǎng)。分為三組,每組各用軟骨誘導(dǎo)液、含100ng/mlGDF-5、2.5μM1-庚醇(1-heptanol)的軟骨誘導(dǎo)液以及含100ng/mlGDF-5的軟骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)培養(yǎng)三周。三周后對各組細(xì)胞進(jìn)行共聚焦激光漂白

2、恢復(fù)測定各組細(xì)胞的熒光恢復(fù)率;免疫熒光染色檢測各組細(xì)胞Ⅱ型膠原和蛋白多糖表達(dá)情況。二、“自組裝”培養(yǎng)。將第三代細(xì)胞按一定密度接種于2％瓊脂糖包被的24孔板,進(jìn)行自組裝培養(yǎng),形成組織團(tuán)塊,培養(yǎng)3周。根據(jù)軟骨誘導(dǎo)液中刺激因子的不同分為三組:A組僅用軟骨誘導(dǎo)液(CM)誘導(dǎo)培養(yǎng);B組用含100ng/mlGDF-5、2.5μM1-heptanol的軟骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)培養(yǎng)(CM+100ng/mlGDF-5+2.5μM1-heptanol);C組用含10

3、0ng/mlGDF-5的軟骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)培養(yǎng)(CM+100ng/mlGDF-5)。對三組的自組裝組織團(tuán)塊進(jìn)行大體觀察;生物化學(xué)分別檢測1,2,3周三組團(tuán)塊GAG的含量變化;Real-timePCR檢測組織團(tuán)塊縫隙連接蛋白43(Cx43)、Ⅱ型膠原和蛋白多糖mRNA的表達(dá);HE染色觀察自組裝組織細(xì)胞結(jié)構(gòu);免疫熒光、番紅O、甲苯胺藍(lán)染色檢測誘導(dǎo)細(xì)胞Cx43、Ⅱ型膠原和蛋白多糖表達(dá)。對免疫熒光圖像每個視野下陽性反應(yīng)物的平均光密度進(jìn)行測定,并對三

4、組進(jìn)行比較。
　　結(jié)果：GDF-5處理組的單層細(xì)胞熒光恢復(fù)率為(42.45%±2.52%),1-heptanol處理組的單層細(xì)胞熒光恢復(fù)率為(22.75±1.86%),空白對照組的單層細(xì)胞熒光恢復(fù)率為(20.18±2.03%),有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。免疫熒光顯示GDF-5處理組細(xì)胞表達(dá)的Ⅱ型膠原和蛋白多糖最為強(qiáng)烈,1-heptanol處理組合空白對照組Ⅱ型膠原和蛋白多糖表達(dá)較弱。通過對hMSCs的自組裝培養(yǎng),形成了類似軟骨

5、的組織團(tuán)塊。A組團(tuán)塊的GAG含量在t=1w為(2.13±0.40),在t=3w為(2.65±0.52);B組團(tuán)塊的GAG含量在t=1w為(3.10±0.30),在t=3w為(3.94±0.45);C組團(tuán)塊的GAG含量在t=1w為(3.536±0.34),在t=3w為(5.918±0.46),增加最為顯著。Cx43、Ⅱ型膠原和蛋白多糖mRNA表達(dá)明顯,免疫熒光顯示Ⅱ型膠原蛋白、蛋白多糖表達(dá)陽性,番紅O染色顯示蛋白多糖表達(dá)陽性。C組自組裝組

6、織塊Ⅱ型膠原、蛋白多糖mRNA表達(dá)明顯大于其他兩組,Cx43表達(dá)強(qiáng)于A組團(tuán)塊,略高于B組,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。A組Ⅱ型膠原免疫熒光平均光密度為(0.3678±0.0321),B組平均光密度為(0.4808±0.0415),C組平均光密度為(0.7112±0.0212),有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。A組aggrecan免疫熒光平均光密度為(0.3778±0.0350),B組平均光密度為(0.4828±0.0401),C組

7、平均光密度為(0.6722±0.0362),有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。A組Cx43免疫熒光平均光密度為(0.4265±0.0524),B組平均光密度為(0.6358±0.0585),C組平均光密度為(0.6872±0.0382),A組與其他兩組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),B、C組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　結(jié)論：應(yīng)用“自組裝”技術(shù)聯(lián)合GDF-5能有效構(gòu)建工程化軟骨,Cx43蛋白介導(dǎo)的縫隙連接細(xì)胞間通訊在“