典型納米材料致大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)和多巴胺能神經(jīng)元的毒性效應(yīng)研究.pdf

1、研究背景及研究目的:
　　帕金森病(Parkinson's disease，PD)是中老年人常見(jiàn)的神經(jīng)退行性疾病之一。其病因主要有遺傳因素和環(huán)境因素。其主要病理表現(xiàn)是黑質(zhì)紋狀體多巴胺能神經(jīng)元(Dopaminergic Neuron，DN)的變性死亡及神經(jīng)元胞漿中路易小體(Lewy's dody)的積聚，引起多巴胺(Dopaminergic，DA)分泌不足，紋狀體DA水平下降。在PD患者中散發(fā)性病例約占95％，他們對(duì)外界環(huán)境毒素存在

2、易感因素。隨著納米科學(xué)和納米技術(shù)的迅猛發(fā)展，納米材料被大規(guī)模生產(chǎn)和廣泛應(yīng)用，人們通過(guò)環(huán)境、生態(tài)、工作場(chǎng)所暴露于各種納米顆粒和納米材料的機(jī)會(huì)和程度也日益增加。由于納米顆粒具有小尺度效應(yīng)和表面效應(yīng)以及由其所造成的巨大比表面積，使其表面有可能產(chǎn)生較多的活性位點(diǎn)來(lái)參加不同的生化反應(yīng)，故具有強(qiáng)大的穿透組織細(xì)胞的能力、較強(qiáng)的氧化能力和催化能力。最近研究表明，中樞神經(jīng)系統(tǒng)(centralnervous system，CNS)是納米顆粒的潛在毒作用靶器

3、官。納米顆粒能穿越血腦屏障進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，對(duì)腦組織造成損傷。吸入暴露后，在鼻腔黏膜上吸附并沉積的納米顆?？山?jīng)嗅神經(jīng)通路進(jìn)入腦組織。雖然納米材料的環(huán)境健康效應(yīng)已得到高度關(guān)注，但納米材料的神經(jīng)毒性研究還處于起步階段，尤其是針對(duì)多巴胺能神經(jīng)元的毒性效應(yīng)及其機(jī)制尚未明了，特別是體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的系統(tǒng)性研究的資料和數(shù)據(jù)十分有限。
　　本研究即對(duì)不同類型納米材料的中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性進(jìn)行了比較，包括兩部分研究?jī)?nèi)容。在第一部分研究中選擇了碳納

4、米材料-單臂碳納米管(single-wallcarbon nanotubes，SWCNTs)、非金屬納米氧化物-納米二氧化硅(SiO2-NPs)和金屬納米氧化物-納米氧化鋅(ZnO-NPs)3種不同種類的納米材料，通過(guò)檢測(cè)非暴露式氣管滴注染毒后大鼠腦組織神經(jīng)遞質(zhì)和氧化應(yīng)激水平，對(duì)其中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性進(jìn)行了比較。在第二部分研究中，在整體動(dòng)物水平上，研究了納米氧化鋁(Al2O3-NPs)、納米氧化銅(CuO-NPs)和納米氧化鋅(ZnO-NP

5、s)3種典型納米金屬氧化物經(jīng)鼻腔滴注暴露后在大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要功能腦區(qū)的分布以及對(duì)相應(yīng)腦區(qū)的損傷作用;在細(xì)胞水平上對(duì)3種納米金屬氧化物致多巴胺能神經(jīng)元模型(PC12細(xì)胞)的毒性效應(yīng)及其機(jī)制進(jìn)行了初步探討，為進(jìn)一步進(jìn)行作用機(jī)制的研究及納米顆粒經(jīng)呼吸暴露后對(duì)機(jī)體的毒性效應(yīng)評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)，為PD等神經(jīng)退行性病變的病因?qū)W研究提供實(shí)驗(yàn)參考，為納米材料環(huán)境健康防護(hù)標(biāo)準(zhǔn)的制定提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)資料。
　　研究?jī)?nèi)容:
　　(1)研究3種不同種

6、類納米材料對(duì)非暴露式氣管滴注染毒大鼠的神經(jīng)毒性效應(yīng);
　　(2)研究3種典型納米金屬氧化物經(jīng)鼻腔滴注在大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要功能腦區(qū)的分布;
　　(3)研究3種典型納米金屬氧化物經(jīng)鼻腔滴注對(duì)大鼠大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要功能腦區(qū)的毒性效應(yīng);
　　(4)研究3種典型納米金屬氧化物對(duì)多巴胺能神經(jīng)元PC12細(xì)胞的毒性效應(yīng);
　　(5) CuO-NPs致多巴胺能神經(jīng)元PC12細(xì)胞毒性作用潛在機(jī)制的初步探討。
　　研究方法:

7、
　　(1)納米材料染毒懸液的制備及參數(shù)表征:SWCNTs、SiO2-NPs、Al2O3-NPs、CuO-NPs和ZnO-NPs，以生理鹽水為分散劑制備納米顆粒懸液，透射電鏡和掃描電鏡觀察納米顆粒的分散狀態(tài)，并對(duì)其粒徑、形狀和化學(xué)組成等基本顆粒參數(shù)進(jìn)行表征。
　　(2)3種不同種類納米材料對(duì)大鼠神經(jīng)毒性研究:SPF級(jí)雄性Wistar大鼠非暴露式氣管滴注SWCNTs、SiO2-NPs、ZnO-NPs，分為生理鹽水對(duì)照組和3種納

8、米材料的高（15 mg/kg體重）、低（3 mg/kg體重）劑量組，隔日染毒1次，共4周。采用生物化學(xué)法檢測(cè)大鼠腦組織氧化損傷指標(biāo)丙二醛(MDA)、還原型谷胱甘肽(GSH)的含量及超氧化物歧化酶(SOD)的活性。采用高效液相色譜法(highperformance liquid chromatography, HPLG)檢測(cè)單胺類神經(jīng)遞質(zhì):腎上腺素(E）、去甲腎上腺素(NE）、多巴胺(DA）、5-羥色胺(5-HT)及其代謝產(chǎn)物5-羥吲哚乙

9、酸(5-HIAA)含量及氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸(Glu)、天門(mén)冬氨酸(Asp)、甘氨酸(Gly)、γ-氨基丁酸(GABA)含量。并將腦組織切片，蘇木精一伊紅(HE）染色后光鏡下進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)檢查。
　　(3)通過(guò)動(dòng)物整體實(shí)驗(yàn)研究3種納米金屬氧化物在大鼠主要腦區(qū)的分布:采用鼻腔滴注方式對(duì)SPF級(jí)雄性Wistar大鼠進(jìn)行染毒，分為生理鹽水對(duì)照組和3種納米材料暴露組(20 mg/kg體重，每組5只)，每天滴注1次，共15天。利用電感耦合

10、等離子體質(zhì)譜法(inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS)分別檢測(cè)大鼠嗅球、海馬、紋狀體、大腦皮質(zhì)、小腦組織中AL、Cu、Zn元素的含量;利用透射電鏡(transmission electron microscope，TEM)觀察嗅球、海馬、紋狀體組織超微結(jié)構(gòu)的變化及納米顆粒在組織中的定位。
　　(4)通過(guò)動(dòng)物整體實(shí)驗(yàn)研究3種納米金屬氧化物對(duì)大鼠主要腦區(qū)的毒性效應(yīng):采用

11、鼻腔滴注方式對(duì)SPF級(jí)雄性Wistar大鼠進(jìn)行染毒，分為生理鹽水對(duì)照組和3種納米材料暴露組(20 mg/kg體重，每組5只)，每天滴注1次，共15天和30天。染毒期間觀察大鼠體重變化;染毒結(jié)束利用生物化學(xué)法檢測(cè)大鼠嗅球、海馬、紋狀體、大腦皮質(zhì)、小腦組織勻漿液中MDA含量、GSH活性，反應(yīng)各腦區(qū)氧化應(yīng)激水平;通過(guò)雙抗夾心酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測(cè)上述腦區(qū)組織勻漿中細(xì)胞因子白介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平，反

12、應(yīng)各腦區(qū)免疫炎性水平。
　　(5)通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究納米材料對(duì)多巴胺能神經(jīng)元PC12細(xì)胞的毒性效應(yīng):以細(xì)胞培養(yǎng)液配制3種納米顆粒混懸液:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20μg/mLZnO-NPs混懸液;5、10、15、20、25、30、35、40、45、50μg/mL CuO-NPs混懸液;3.125、6.25、12.5、25、50、100、200μg/mL Al2O3-NPs混懸液。分別與PC12細(xì)胞共培養(yǎng)，通

13、過(guò)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、CCK-8實(shí)驗(yàn)和乳酸脫氫酶(LDH)滲漏分析評(píng)價(jià)納米材料對(duì)細(xì)胞活性和細(xì)胞膜完整性的影響;通過(guò)nnexinⅤ-FITC/PI雙染結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡。通過(guò)碘化丙啶(PI)單染結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)分析Al2O3-NPs、CuO-NPs致PC12細(xì)胞周期的變化;通過(guò)比色法檢測(cè)CuO-NPs暴露后PC12細(xì)胞裂解液中MDA、一氧化氮(NO)含量、總超氧化物歧化酶(SOD)、GSH、總GSH活性，探討CuO-NPs是否通過(guò)氧化應(yīng)

14、激機(jī)制引發(fā)PC12細(xì)胞毒損傷。
　　研究結(jié)果:
　　1納米顆粒的參數(shù)表征
　　5種納米材料粒徑均＜40 nm，純度在99.7％以上，Al2O3-NPs和CuO-NPs為規(guī)則球形顆粒，SiO2-NPs、ZnO-NPs為六邊形晶體結(jié)構(gòu)，SWCNTs為束狀纖維，直徑約8nm，管長(zhǎng)小于5μm，符合實(shí)驗(yàn)要求。
　　2整體動(dòng)物水平實(shí)驗(yàn)研究
　　(1)3種不同種類納米材料對(duì)大鼠神經(jīng)毒性研究:非暴露式氣管滴注染毒4周后，S

15、WCNTs低劑量組大鼠腦組織MDA含量顯著升高，高、低劑量組SOD活性均顯著降低;ZnO-NPs高、低劑量組MDA含量均顯著升高，高劑量組SOD活性顯著降低。ZnO-NPs高、低劑量組抑制性單胺類神經(jīng)遞質(zhì)DA、5-HT和5-HIAA含量均顯著降低;SWCNTs高劑量組DA含量顯著降低。ZnO-NPs高劑量組興奮性氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)Glu含量顯著升高;SWCNTs高劑量組Glu、Asp含量顯著升高;SiO2-NPs高、低劑量組Asp含量及低

16、劑量組Glu含量顯著升高。ZnO-NPs高劑量組大鼠腦組織可見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)。
　　(2)3種納米金屬氧化物在大鼠腦組織中的分布:Al2O3-NPs、CuO-NPs和ZnO-NPs分別經(jīng)鼻腔滴注暴露15 d后，ICP-MS檢測(cè)發(fā)現(xiàn)大鼠嗅球、海馬和紋狀體組織中Al、Cu元素含量顯著升高，大腦皮質(zhì)和小腦組織中Al、Cu元素含量有升高的趨勢(shì)，但沒(méi)有顯著性差異;各腦區(qū)中Zn元素含量有升高的趨勢(shì)，但沒(méi)有顯著性差異。同時(shí)TEM檢測(cè)發(fā)現(xiàn)3種納米從材

17、料染毒組大鼠嗅球、海馬、紋狀體組織胞核和胞漿內(nèi)有納米顆粒沉積，并造成相應(yīng)腦區(qū)神經(jīng)纖維排列疏松、核膜缺損、染色質(zhì)凝集、線粒體損傷、胞漿內(nèi)形成空泡，甚至細(xì)胞壞死。
　　(3)3種納米金屬氧化物對(duì)大鼠腦組織的毒性作用:3種納米顆粒暴露均可造成大鼠體重顯著降低。3種納米材料暴露15 d后，大鼠嗅球、海馬、紋狀體組織中GSH含量顯著降低，MDA的含量顯著升高;且ZnO-NPs亦可致大腦皮質(zhì)GSH含量顯著降低。3種納米材料暴露30 d后，大鼠

18、嗅球、海馬、紋狀體、大腦皮質(zhì)組織中GSH含量顯著降低，嗅球、海馬、紋狀體組織中MDA的含量顯著升高;且ZnO-NPs亦可造成小腦GSH含量顯著降低，大腦皮質(zhì)和小腦MDA含量顯著升高;CuO-NPs亦可造成大腦皮質(zhì)MDA的含量顯著升高。3種納米材料暴露15、30d后，大鼠嗅球、海馬、紋狀體組織IL-1β、TNF-α水平顯著升高，且ZnO-NPs亦可造成小腦組織TNF-α水平顯著升高;Al2O3-NPs暴露30 d后亦可造成大腦皮質(zhì)、小腦組

19、織中TNF-α水平顯著升高。
　　3體外細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)研究
　　(1)形態(tài)學(xué):對(duì)照組PC12細(xì)胞（分化型）形態(tài)正常，突起較長(zhǎng)，細(xì)胞間突起連接點(diǎn)較多，胞質(zhì)透明度較大。染毒組出現(xiàn)不同程度的回縮變形，變圓漂浮、飽核固縮、胞內(nèi)形成許多空泡;細(xì)胞突起變短減少，甚至消失，細(xì)胞間突起連接點(diǎn)減少;胞質(zhì)內(nèi)顆粒物增多，透明度下降，細(xì)胞間隙和細(xì)胞表面有納米顆粒分布，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝造成顯著影響，導(dǎo)致活細(xì)胞數(shù)明顯減少。ZnO-NPs和CuO-NPs

20、暴露后對(duì)PC12細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響尤為嚴(yán)重。
　　(2)細(xì)胞毒性:3種納米顆?？娠@著降低PC12細(xì)胞活性，且呈現(xiàn)劑量依賴性和時(shí)間依賴性，在實(shí)驗(yàn)暴露時(shí)間內(nèi)低劑量(＜10μg/mL)的ZnO-NPs對(duì)PC12細(xì)胞不產(chǎn)生毒性作用，而當(dāng)暴露劑量超過(guò)一定限值(＞12μg/mL)時(shí)即可造成PC12細(xì)胞大量死亡。3種納米顆?？稍斐杉?xì)胞培養(yǎng)液上清中LDH活性顯著升高，且CuO-NPs在低劑量(5μg/mL)時(shí)即已經(jīng)顯著高于對(duì)照組，而Al2O3-NP

21、s和ZnO-NPs對(duì)胞外LDH釋放的作用較弱。
　　(3)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡:3種納米顆粒可引發(fā)PC12細(xì)胞凋亡和壞死，低劑量、短時(shí)間暴露時(shí)細(xì)胞凋亡在細(xì)胞死亡進(jìn)程中發(fā)揮主導(dǎo)作用，而隨著染毒時(shí)間的延長(zhǎng)和染毒劑量的增加細(xì)胞壞死逐漸發(fā)揮主導(dǎo)作用。Al2O3-NPs暴露24 h可導(dǎo)致PC12細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，同時(shí)伴隨著G2/M期細(xì)胞數(shù)量顯著降低;低劑量(10μg/mL)CuO-NPs暴露可導(dǎo)致PC12細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，

22、而隨著暴露劑量(20、40μg/mL)的增加細(xì)胞周期則阻滯在S期，同時(shí)伴隨著G2/M期細(xì)胞數(shù)的顯著降低。
　　(4) CuO-NPs致PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激水平:各劑量水平的CuO-NPs暴露均可造成PC12細(xì)胞GSH水平顯著降低;10～30μg/mL劑量暴露組PC12細(xì)胞總GSH水平顯著降低;15～30μg/mL劑量暴露組PC12細(xì)胞總SOD活性顯著降低，NO含量顯著升高;20～30μg/mL劑量暴露組MDA含量顯著升高，GSH/

23、GSSG比值顯著降低。
　　研究結(jié)論:
　　(1)3種不同類型的納米材料氣管滴注暴露后，ZnO-NPs和SWCNTs可致腦組織氧化損傷，抗氧化水平降低，清除自由基的能力顯著下降;ZnO-NPs可影響抑制性單胺類神經(jīng)遞質(zhì)DA、5-HT、5-HIAA和興奮性氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)Glu的合成與代謝，SWCNTs可影響DA和興奮性氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)Glu、Asp的合成與代謝，SiO2-NPs可影響Glu、Asp的合成與代謝，說(shuō)明導(dǎo)致中樞神

24、經(jīng)系統(tǒng)功能損傷;且ZnO-NPs可對(duì)腦組織造成組織病理性損傷，出現(xiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)。
　　(2)3種納米金屬氧化物鼻腔滴注暴露后可沿嗅神經(jīng)轉(zhuǎn)運(yùn)至中樞神經(jīng)系統(tǒng)，引發(fā)大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)氧化應(yīng)激和免疫炎性反應(yīng)發(fā)生，造成腦組織超微結(jié)構(gòu)損傷。氧化應(yīng)激和免疫炎性反應(yīng)可能是納米顆粒引發(fā)神經(jīng)毒性效應(yīng)的主要作用機(jī)制之一，符合目前普遍認(rèn)同的PD發(fā)病機(jī)制，提示這3種納米顆?？赡軙?huì)增加PD的易感性。
　　(3)3種納米金屬氧化物可降低細(xì)胞活性;通過(guò)影響細(xì)胞

25、膜的完整性和通透性抑制細(xì)胞活性;引起細(xì)胞凋亡;通過(guò)阻滯細(xì)胞周期抑制細(xì)胞增殖。同時(shí)可引發(fā)多巴胺能神經(jīng)元PC12細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，使細(xì)胞突起變短，細(xì)胞間突起結(jié)點(diǎn)變少甚至消失，提示3種納米顆粒可能通過(guò)損傷神經(jīng)元的神經(jīng)突起，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞間的物質(zhì)運(yùn)輸和信息傳遞無(wú)法正常進(jìn)行，進(jìn)而對(duì)生物體的神經(jīng)系統(tǒng)功能造成損傷，導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性。
　　(4) CuO-NPs可致PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激水平升高，可能通過(guò)氧化應(yīng)激機(jī)制引發(fā)PC12細(xì)胞毒性作用。并且造

26、成PC12細(xì)胞內(nèi)NO的含量急劇升高，提示，CuO-NPs可能會(huì)造成多巴胺能神經(jīng)元對(duì)DA的代謝異常，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)元的神經(jīng)調(diào)節(jié)功能損傷;另外，NO通過(guò)與細(xì)胞內(nèi)的超氧陰離子合成強(qiáng)效的氧化劑-過(guò)氧亞硝基陰離子，對(duì)PC12細(xì)胞造成氧化損傷。
　　(5)3種納米金屬氧化物和SWCNTs可能會(huì)增加PD的易感性，是PD的環(huán)境促進(jìn)因素之一。
　　(6)3種不同類型的納米材料間比較，無(wú)機(jī)納米金屬氧化物ZnO-NPs毒性作用最強(qiáng)，碳納米材料SWC