基于聚乙烯亞胺的兩類基因遞送載體的構建及其體內(nèi)外轉染特性研究.pdf

1、研究背景：
　　基因治療是一種通過載體將核酸、反義寡核苷酸或者小干擾RNA等基因藥物遞送到靶細胞內(nèi)，通過調(diào)控特定基因表達，達到治療疾病目的的生物醫(yī)學治療方法。基因治療不僅可以用于遺傳性疾病的治療，而且可為預防和治療癌癥、病毒感染、糖尿病以及艾滋病等提供良好的方法，已成為生物醫(yī)學治療的重要組成部分?；蛑委煹某晒崿F(xiàn)離不開優(yōu)良的基因遞送載體，基因遞送載體主要分為病毒和非病毒載體。病毒載體的基因轉染效率較高，但是由于其負載基因片段大小

2、有限制，具有免疫原性，難以實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，有可能產(chǎn)生插入突變以及可能引起嚴重的安全問題等，使其臨床應用受到限制。非病毒載體生產(chǎn)成本相對較低，具有低的免疫原性和細胞毒性，可遞送較大片段的基因等許多優(yōu)點，已經(jīng)成為基因遞送載體研究的熱點。
　　聚乙烯亞胺（Polyethyleneimine，PEI）是一種被廣泛研究的基因遞送非病毒載體，在不同細胞和轉染條件下展現(xiàn)出穩(wěn)定高效的基因轉染效果，其中PEI25k更被視作基因轉染的“黃金標準”。高

3、密度的伯胺、仲胺和叔胺基團使得 PEI在較廣的 pH范圍內(nèi)具有顯著的緩沖能力，該特性被稱作“質子海綿效應”，也是PEI高轉染活性的關鍵因素之一。雖然 PEI在基因遞送領域具有極為廣闊的應用前景，但仍存在體內(nèi)轉染效率低，細胞毒性大和溶酶體降解等亟需解決的問題。因此，以 PEI為基礎設計構建高效低毒的基因遞送載體具有重要的理論意義和實用價值。
　　研究目的：
　　綜合考慮基因治療和 PEI遞送載體的研究現(xiàn)狀，分別以線性和支化聚乙

4、烯亞胺為起始原料，設計并合成兩類新型遞送載體并用于基因轉染研究。第一類是以線性聚乙烯亞胺LPEI25k和α-環(huán)糊精為原料，制備得到超分子準聚輪烷，并以2,4-二硝基苯甲醛作為封端基團，合成得到酸敏封端和非酸敏封端的兩種新型聚輪烷，以期獲得高轉染效率和低毒性的基因遞送載體。第二類是以支化聚乙烯亞胺 BPEI25k為原料，制備得到甘露醇修飾的陽離子聚合物，通過甘露醇的引入增強小窩蛋白介導的內(nèi)吞途徑對基因載體的胞內(nèi)轉運，從而一定程度避免溶酶體

5、的降解，以期獲得高效低毒的基因遞送載體。
　　實驗方法：
　　1、以 LPEI25k和α-環(huán)糊精為起始原料，通過主客體分子的包合作用得到準聚輪烷LPEI25k/CD，并以2,4-二硝基苯甲醛作為封端基團，通過醛胺縮合得到酸敏基團席夫堿封端的聚輪烷LPEI25k/CD-PA，繼而使用氰基硼氫化鈉對席夫堿進行還原，得到非酸敏基團封端的聚輪烷LPEI25k/CD-PB。以BPEI25k為起始原料，通過還原胺化反應制備得到4種不同取

6、代度甘露醇修飾的陽離子聚合物基因載體。通過核磁共振氫譜、紅外光譜和元素分析對合成中間體和載體材料結構進行鑒定。
　　2、通過凝膠阻滯實驗測定上述兩類載體材料對pDNA的復合能力；采用納米粒度和Zeta電位分析儀對載體材料/pDNA復合物的粒徑、PDI和Zeta電位進行表征；利用流式細胞儀以及熒光顯微鏡，以表達增強綠色熒光蛋白的pEGFP為遞送基因，以基因轉染的“黃金標準”PEI25k作為陽性對照，在HEK293T細胞評價所合成的7

7、種基因遞送載體材料的體外轉染活性，并且在血清存在下對優(yōu)選的基因遞送載體材料的轉染活性進行了評價；使用MTT實驗對優(yōu)選的2種基因遞送載體材料的毒性進行測定。
　　3、通過3種特異性的內(nèi)吞途徑抑制劑對優(yōu)選載體材料 LPEI25k/CD和BPEI25k-man-L的入胞機制進行研究。以14位酪氨酸磷酸化小窩蛋白-1表達作為檢測指標，采用Western-blot實驗，對甘露醇修飾的BPEI25k-man-L的內(nèi)吞介導機制進行研究。

8、　　4、以裸鼠為實驗對象，采用尾靜脈注射的方法，以 pEGFP基因為報告基因，觀察GFP在動物體內(nèi)的表達及分布情況，對優(yōu)選的載體材料進行體內(nèi)轉染活性評價。結果與討論：
　　1、LPEI25k準聚輪烷和聚輪烷基因遞送載體的構建與評價
　?。?）經(jīng)核磁共振氫譜和紅外光譜鑒定，所合成的準聚輪烷LPEI25k/CD及聚輪烷LPEI25k/CD-PA和LPEI25k/CD-PB均為目標產(chǎn)物。
　　（2）LPEI25k/CD，LP

9、EI25k/CD-PA和LPEI25k/CD-PB/pDNA復合物的平均粒徑分別是384.9、175.4和162.6 nm，粒徑分布的多分散性指數(shù)分別是0.333、0.150和0.198，復合物的Zeta電位分別3.57、4.03和5.54 mV，三種材料都可以和pDNA形成規(guī)則球形并且荷正電的納米粒，可以用于基因的遞送研究。凝膠阻滯實驗表明，3種載體都可以在重量比1:1時完全復合pDNA，其中準聚輪烷LPEI25k/CD可以在更低的重

10、量比1:2下與pDNA復合完全，具有和陽性對照LPEI25k相當?shù)膹秃夏芰?，同時展現(xiàn)出比聚輪烷LPEI25k/CD-PA和LPEI25k/CD-PB更好的復合能力。
　?。?）體外基因轉染活性研究結果表明，與LPEI25k相比，準聚輪烷LPEI25k/CD展現(xiàn)出與之相當甚至較高的轉染活性，聚輪烷LPEI25k/CD-PA和LPEI25k/CD-PB雖然展現(xiàn)出較低或相當?shù)钠骄鶡晒鈴姸?，但是陽性轉染細胞數(shù)較低。與酸敏鍵封端的LPEI2

11、5k/CD-PA相比，非酸敏鍵封端的LPEI25k/CD-PB在三種N/P下均表現(xiàn)出較低的陽性轉染細胞數(shù)和平均熒光強度，表明酸敏鍵封端的聚輪烷比非酸敏鍵封端的聚輪烷表現(xiàn)出更好的轉染效率。在10％血清存在下，LPEI25k在N/P重量比10:1，20:1和50:1的情況下轉染效率均明顯的降低；但是對于LPEI25k/CD而言，在重量比為10:1時，陽性轉染細胞數(shù)和平均熒光強度均與不加血清條件下的轉染效果相當。而且，當N/P重量比增至20:

12、1和50:1時，相對于LPEI25k，LPEI25k/CD的轉染受血清的影響較小，表現(xiàn)出穩(wěn)定的轉染效率和體內(nèi)應用前景。
　?。?）MTT實驗結果表明，LPEI25k/CD（IC50=30.7μg/mL）比LPEI25k（IC50=20.0μg/mL）表現(xiàn)出更低的毒性，具有更好的生物相容性和安全性。
　?。?）酶降解保護實驗表明，LPEI25k/CD和LPEI25k都具有良好的pDNA保護能力。進一步的基因釋放能力實驗表明，與

13、 LPEI25k相比，LPEI25k/CD復合物中pDNA的解離釋放更為容易。
　?。?）內(nèi)吞途徑抑制實驗結果顯示，LPEI25k/CD/pDNA復合物的主要入胞機制為網(wǎng)格蛋白介導的內(nèi)吞途徑。
　?。?）體內(nèi)轉染實驗結果表明，LPEI25k/CD/pDNA復合物單次給藥后可以在裸鼠體內(nèi)有效和持續(xù)地表達GFP，能夠高效遞送的主要器官依次為睪丸、腦、肝、肺、腎、脾臟和心臟。
　　2、BPEI25k陽離子聚合物基因遞送載體的

14、構建與評價
　?。?）經(jīng)核磁共振氫譜和紅外光譜鑒定，所合成的4種 BPEI25k陽離子聚合物BPEI25k-man-S/L/M/H均為目標產(chǎn)物。經(jīng)元素分析測定，BPEI25k-man-S/L/M/H中甘露醇的接枝度分別為20.8、47.0、56.2和171.1個。
　　（2）BPEI25k-man-S/L/M3種陽離子聚合物在四種N/P重量比下與pDNA形成的納米復合物的粒徑，PDI和Zeta電位與BPEI25k相當，BPE

15、I25k-man-H的電位和BPEI25k相當，但是其粒徑較大。凝膠阻滯實驗結果顯示，除了BPEI25k-man-H在N/P為1:1時與pDNA完全復合，BPEI25k-man-S/L/M3種陽離子聚合物均可以在低氮磷比N/P為1:2時與pDNA完全復合。4種陽離子聚合物均符合基因載體的基本要求，可以進行進一步的研究。
　　（3）體外轉染結果表明，在低氮磷比N/P為1:2時，4種載體材料的轉染效率均低于BPEI25k（N/P為2:

16、1）；在N/P為2:1、5:1和10:1時，BPEI25k-man-L具有和對照相當?shù)年栃赞D染細胞數(shù)和平均熒光強度，BPEI25k-man-S和 BPEI25k-man-M的陽性細胞數(shù)低于對照，但是平均熒光強度與之相當，BPEI25k-man-H的陽性細胞數(shù)和平均熒光強度均低于對照。其中具有適度甘露醇接枝度的BPEI25k-man-L在N/P為2:1、5:1和10:1時均表現(xiàn)出和陽性對照相當?shù)霓D染效率，可作為候選基因載體進行進一步的研究

17、。10%血清存在下的轉染結果顯示，對照BPEI25k在N/P重量比2:1時的陽性轉染細胞數(shù)明顯降低，但是 BPEI25k-man-L的轉染活性與不加血清下的轉染效果相當，表現(xiàn)出穩(wěn)定的轉染效率和極好的體內(nèi)應用前景。
　?。?）MTT實驗結果表明，BPEI25k-man-L（IC50=31.4μg/mL）比陽性對照BPEI25k（IC50=15.3μg/mL）展現(xiàn)出更低的毒性，表現(xiàn)出更好的生物相容性和安全性。
　?。?）酶降解保

18、護實驗結果顯示，BPEI25k-man-L和陽性對照BPEI25k都具有良好的pDNA保護能力。
　?。?）內(nèi)吞途徑抑制實驗結果顯示，BPEI25k/pDNA復合物在 HEK293T細胞主要通過網(wǎng)格蛋白介導的內(nèi)吞和小窩蛋白介導的內(nèi)吞入胞，其中，網(wǎng)格蛋白介導的內(nèi)吞途徑占稍大的比例；甘露醇修飾的BPEI25k-man-L/pDNA復合物在HEK293T細胞上可通過3種內(nèi)吞途徑入胞，主要通過小窩蛋白介導的內(nèi)吞入胞。上述研究結果表明，對B

19、PEI25k進行甘露糖醇修飾可改變BPEI25k的內(nèi)吞途徑，增強小窩蛋白介導的內(nèi)吞。進一步的 Western-blot實驗結果顯示，經(jīng)由甘露醇修飾后的基因載體BPEI25k-man-L可激活Src酪氨酸激酶誘導的小窩蛋白-1的磷酸化，刺激小窩的形成和從質膜脫落入胞，從而增強小窩蛋白途徑介導的基因載體入胞。
　　（7）體內(nèi)轉染實驗結果表明，BPEI25k-man-L/pDNA復合物單次給藥即可展示很好的體內(nèi)轉染效果，可以在體內(nèi)持續(xù)地

20、表達 GFP，能夠高效遞送的主要器官依次為腦、睪丸、肝、腎、肺、心臟和脾臟。
　　結論：
　　本文設計合成了兩類7種基于PEI的準聚輪烷和聚輪烷及陽離子聚合物基因載體，并對其進行了結構表征、體內(nèi)外基因轉染活性和入胞機制的研究。實驗研究結果顯示，所得7種基因載體材料均為目標產(chǎn)物。兩類載體材料中準聚輪烷LPEI25k/CD和甘露醇修飾的 BPEI25k-man-L轉染效果最好，表現(xiàn)出高效低毒的特性。入胞途徑研究結果顯示，LPEI