荷載紫杉醇藥物的普朗尼克(F127)-聚乙烯亞胺(PEI)多功能膠束的構(gòu)建及其體內(nèi)外評價.pdf

1、紫杉醇(paclitaxel,PTX,商品名Taxol)是從紅豆杉屬植物中分離提取的一種含有紫杉烷結(jié)構(gòu)的抗癌藥,具有微管穩(wěn)定作用,進而抑制細(xì)胞有絲分裂,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,是一種高效的細(xì)胞毒類藥物。紫杉醇于1992年12月通過了美國國家食品與藥品管理中心的批準(zhǔn),成為晚期卵巢癌的治療藥物,隨后又批準(zhǔn)用于治療乳腺癌。目前,紫杉醇已成功地應(yīng)用于乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、卵巢癌、卡波氏肉瘤在內(nèi)的多種惡性腫瘤的治療,成為世界抗癌首選藥物。
　　 紫

2、杉醇的理化性質(zhì)表明,其在水中溶解度約0.25μg/ml,在正辛醇中易溶,脂溶性強,因此增加紫杉醇溶液度成為其廣泛應(yīng)用的限制因素之一。臨床應(yīng)用的主要是紫杉醇注射液,即由乳浮EL(Cremophor EL,含聚氧乙烯蓖麻油)/無水乙醇(50:50)制成的無色薪稠狀濃溶液,主要用于卵巢癌和乳腺癌。但是大量研究表明,紫杉醇注射液中的cremop horEL易引起過敏反應(yīng)、腎毒性、神經(jīng)毒性、呼吸抑制、嗜睡和低血壓,極大地限制了臨床應(yīng)用。由于油針的

3、劑型一直沒有在臨床上應(yīng)用,目前在申報的水針劑,多采用脂質(zhì)體、納米粒等技術(shù)以期解決水溶性低的問題。
　　 基于上述原因,為提高其水溶性及靶向性,降低毒副作用,本文以聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯(PEO-PPO-PEO)三嵌段共聚物普朗尼克(Pluronic)F127為載體材料,F127濃度在臨界膠束濃度(CMC)以上時,在水中會自發(fā)形成以聚氧乙烯為親水外殼,聚氧丙烯為疏水內(nèi)核的納米膠束,疏水性藥物紫杉醇增溶在疏水性內(nèi)核部分。因帶正

4、電荷的微粒易于靶向肺組織,為提高紫杉醇肺靶向性及克服膠束進入體循環(huán)系統(tǒng)被稀釋后易于分解現(xiàn)象,以低分子量聚乙烯亞胺為交聯(lián)劑,采用外殼交聯(lián)法將普朗尼克F127外殼交聯(lián),形成穩(wěn)定膠束,交聯(lián)后的膠束在生理條件下帶正電荷,不但提高其稀釋穩(wěn)定性,而且提高了其肺靶向性。將葉酸(Folic Acid,FOL)引入嵌段共聚物F127的端基上(F127-FOL),然后與F127-PEI按一定質(zhì)量比(9:1)組成混合膠束,提高其主動靶向性和穩(wěn)定性。本課題的研

5、究過程及結(jié)果如下:
　　 1.采用乳化溶劑蒸發(fā)法合成低分子量PEI交聯(lián)普朗尼克F127共聚物(F127-PEI)。首先利用羰基二咪唑(CDI)活化F127,然后利用低分子量PEI的分枝結(jié)構(gòu)末端豐富的伯氨基,將PEI與活化的F127(Activated-F127)交聯(lián)起來,從而制得交聯(lián)化的納米膠束。根據(jù)乳化/溶劑蒸發(fā)法的實際制備過程,以載藥量和包封率為主要考察指標(biāo),以臨界膠束濃度(CMC值)為次要考察指標(biāo),通過單因素實驗考察活化的

6、F127與PEI的質(zhì)量比、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溫度、水相體積、乳化時間等因素的影響,確定制備工藝。根據(jù)單因素考察結(jié)果,得出最佳處方及工藝為:活化的F127與PEI質(zhì)量比為25,水相體積為10mL,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溫度為30℃,乳化時間為3min。
　　 葉酸修飾的F127嵌段共聚物的合成:首先利用羰基二咪唑(CDI)活化FOL,然后用活化的FOL與F127末端的羥基反應(yīng),即得F127-FOL。
　　 合成的載體材料的結(jié)構(gòu)表征,Activat

7、ed-F127的紅外光譜特征峰:1761.54cm-1為咪唑中羰基峰,由此可說明已形成CDI活化的Activated-F127生成。F127-PEI的紅外光譜特征峰:3422.43cm-1為NH的伸縮振動吸收峰,1717.16cm-1為羰基峰,由此可表征F127-PEI共聚物的結(jié)構(gòu)。F127-FOL的1H-NMR光譜特征峰:δ:1.03(CH3 in PPO of F127),1.1～1.48(m,CH2CH2CO of folate)

8、,3.33(H2O),3.42～3.48(s,CH in PPO of F127),3.50(s,CH2CH2O of F127),3.6(d,CH2 in PPO ofF127),4.5(d,NCHCO of folate),6.6(d,3,5-H of benzene ring in folate),7.6(d,2,6-H of benzene ring in folate),8.6(s,C7-H in pteridine prot

9、on of folate),由此可表征F127-PEI共聚物的結(jié)構(gòu)。
　　 通過紫外分光光光度計測得F127-PEI中PEI的含量以及F127-FOL中葉酸的含量,以驗證實驗中PEI和葉酸的接枝率。
　　 2.采用薄膜水化法制備荷載紫杉醇(PTX)的F127-PEI(PTX-F127-PEI)共聚物膠束,以載藥量、包封率為指標(biāo),在單因素實驗初選的基礎(chǔ)上,采用四因素、五水平的星點設(shè)計-效應(yīng)面優(yōu)化法進行了PTX膠束處方的優(yōu)化

10、,獲得較優(yōu)處方為:PTX為2.5mg,水化體積為10mL,水相pH為6.9,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溫度為32.5℃。PTX的F127-PEI/F127-FOL共聚物膠束按最優(yōu)處方進行制備。膠束的理化性質(zhì)考察結(jié)果顯示,膠束呈圓球形,大小比較均勻,微有交聯(lián),F127膠束,F127-PEI膠束及F127-PEI/F127-FOL混合膠束的粒徑分別為19.19nm、56.45nm、68.77nm,表面電荷分別為-9.49、7.67、-5.20mV。
　

11、　 3.體外釋放結(jié)果表明,PTX-F127-PEI共聚物膠束和PTX-F127-PEI/F127-FOL混合膠束均具有促進釋放的作用,聚乙烯亞胺和葉酸中均具有pH響應(yīng)結(jié)構(gòu),由PTX共聚物膠束釋放結(jié)果可知,在同一pH條件下交聯(lián)膠束的藥物釋放快于未交聯(lián)膠束,具有pH敏感性。
　　 4.采用MTT比色法研究并比較PTX-F127膠束、PTX-F127-PEI膠束、PTX-F127-PEI/F127-FOL,混合膠束及PTX溶液對He

12、La腫瘤細(xì)胞體外生長及增值的影響,評價體內(nèi)外抗腫瘤活性。結(jié)果表明,紫杉醇的抗腫瘤活性為:PTX-F127-PEI/F127-FOL混合膠束＞PTX-F127膠束＞PTX-F127-PEI膠束＞PTX溶液,半數(shù)抑制濃度分別為:0.425、1.106、1.776及17.781μg/mL。由于PEI具有較強的滲透作用,能破壞細(xì)胞的溶酶體,具有一定的細(xì)胞毒性,所以還進行了活化的F127與PEI不同質(zhì)量比所形成的空白膠束的MTT。實驗,結(jié)果顯示,

13、細(xì)胞抑制率隨著低分子量PEI量的減少而降低,但細(xì)胞抑制率均小于6％。遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于高分子量PEI(25kDa)的毒性。
　　 由細(xì)胞攝取實驗可知,隨著時間的延長,細(xì)胞的熒光強度呈現(xiàn)先升后降的拋物線性狀。三種膠束組在細(xì)胞中的蓄積度均高于游離羅丹明B溶液組,葉酸實驗組高于非葉酸組和葉酸陰性對照組。
　　 5.小鼠靜脈注射Taxol注射液、PTX-F127-PEI膠束、PTX-F127-PEI/F127-FOL混合膠束后,小鼠血藥濃

14、度測定結(jié)果用DAS2.0藥代動力學(xué)程序進行處理,三種制劑均符合雙室模型特征,藥物動力學(xué)方程分別為C=1.449e-5.076t+0.438e-0.147t,C=60.960e-14.447t+0.736e-0.032t,C=1.449e-2.342t+0.273e-0.022t。通過對三種制劑進行藥動學(xué)參數(shù)比較可知,PTX-F127-PEI膠束與PTX-F127-PEI/F127-FOL混合膠束的AUC值(13.380(mg/L)*h,

15、5.868(mg/L)*h)和t1/2β(21.444,31.135h)明顯高于Taxol注射液組的AUC值(2.767(mg/L)*h)和t1/2β(4.963h);PTX-F127-PEI膠束組與PTX-F127-PEI/F127-FOL混合膠束的機體清除率CL(0.095L/h/kg和0.415L/h/kg)小于Taxol注射液組機體清除率CL(0.792L/h/kg);與Taxol注射液的平均滯留時間MRT(2.533h)相比,

16、PTX-F127-PEI膠束的MRT延長至9.404h,PTX-F127-PEI/F127-FOL混合膠束的MRT延長至9.586h。證明兩組膠束制劑可顯著延長藥物在體內(nèi)的存留時間,具有緩釋長效的作用。
　　 6.小鼠組織分布試驗表明,與Taxol注射液相比,PTX-F127-PEI膠束組和PTX-F127-PEI/F127-FOL混合膠束組使藥物在小鼠體內(nèi)各組織器官的分布發(fā)生明顯的變化。兩膠束組肺內(nèi)的總靶向效率(Te)均高于注

17、射液組,相對攝取率re分別為3.687和3.119,濃度提高到4.256倍和3.720倍,其中PTX-F127-PEI/F127-FOL混合膠束的總靶向效率高于PTX-F127-PEI膠束,而相對攝取率和峰濃度比小于PTX-F127-PEI膠束,具有明顯的肺靶向作用;PTX-F127-PEI膠束的血漿相對攝取率re為8.879,PTX-F127-PEI/F127-FOL混合膠束的相對攝取率re為2.742,而兩組膠束制劑在肝、脾、腎的峰