miR-148a-TGF-β信號(hào)通路在光甘草定抑制腫瘤干細(xì)胞樣特性中的作用.pdf

1、近年來(lái)流行病學(xué)研究表明，一些植物化學(xué)物的攝入水平與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，并且由于其高效、低毒的特性備受關(guān)注。它們可通過(guò)抑制致癌物在體內(nèi)的活化，誘導(dǎo)細(xì)胞保護(hù)酶，抑制炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)免疫活動(dòng)，阻滯細(xì)胞周期和促進(jìn)細(xì)胞凋亡，改變信號(hào)通路等多種途徑發(fā)揮抗腫瘤作用。光甘草定(Glabridin，GLA)作為甘草的主要有效成分之一，也具有廣泛的藥理活性，如美白、抗炎、抗菌、抗氧化、心血管和神經(jīng)保護(hù)作用。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，光甘草定也具有抑制腫瘤增殖、侵

2、襲轉(zhuǎn)移和血管生成等作用。
　　腫瘤干細(xì)胞是存在于腫瘤組織中的一小部分具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞群體，它們具有自我更新、高度增殖和多向分化能力，在腫瘤的發(fā)生、侵襲轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及耐藥等方面起著決定性的作用。腫瘤干細(xì)胞的存在很好地解釋了腫瘤在治療初期會(huì)有縮小甚至消失，但會(huì)很快復(fù)發(fā)導(dǎo)致患者死亡的現(xiàn)象。深入研究腫瘤干細(xì)胞的生物學(xué)特性以及相關(guān)信號(hào)通路并針對(duì)腫瘤干細(xì)胞尋找特異性靶向藥物，成為腫瘤治療新的理論基礎(chǔ)和途徑。
　　miRNA可作為癌基因

3、或抑癌基因廣泛參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等多個(gè)生物學(xué)過(guò)程并成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)。miRNA在腫瘤干細(xì)胞中也發(fā)揮著重要的作用，目前已發(fā)現(xiàn)多個(gè)miRNA能夠通過(guò)靶向調(diào)控多個(gè)靶基因的表達(dá)進(jìn)而作用于下游的多條信號(hào)通路，最終影響腫瘤干細(xì)胞的致瘤能力并改變其惡性表型。因此，以miRNA為治療靶點(diǎn)的治療策略將成為腫瘤治療的一個(gè)新的途徑。
　　基于以上研究背景，假設(shè)光甘草定可通過(guò)改變某些miRNA的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控與腫瘤干細(xì)胞特性相關(guān)的信號(hào)通路從而發(fā)揮抑

4、制腫瘤干細(xì)胞樣特性的作用，為光甘草定在腫瘤預(yù)防及治療的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。
　　目的:
　　本研究采用人乳腺癌細(xì)胞(MDA-MB-231、Hs-578T)和人肝癌細(xì)胞（HepG2、MHCC97H、Huh7）為體外模型，以MDA-MB-231細(xì)胞接種裸鼠形成的移植瘤為體內(nèi)模型，探討光甘草定能否通過(guò)miRNA抑制腫瘤干細(xì)胞樣特性發(fā)揮抗腫瘤作用。
　　方法:
　　采用RT-PCR及qRT-PCR檢測(cè)光甘草定對(duì)miR-14

5、8a、腫瘤干細(xì)胞表面抗原的影響;采用流式細(xì)胞術(shù)、軟瓊脂集落實(shí)驗(yàn)及懸浮球形成實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的側(cè)群細(xì)胞比例、增殖程度及自我更新能力;采用qRT-PCR及WesternBlot檢測(cè)TGF-β信號(hào)通路中SMAD2的表達(dá)和磷酸化水平，以及snail的表達(dá);采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)miR-148a對(duì)SMAD2的靶向抑制作用;采用甲基化特異性PCR檢測(cè)光甘草定對(duì)miR-148a啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平的影響;用免疫組化檢測(cè)SMAD2的組織表達(dá)及

6、定位情況。
　　結(jié)果:
　　1.光甘草定對(duì)腫瘤干細(xì)胞樣特性的影響
　　用10μM GLA分別處理乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞0、24、48和72 h后，乳腺癌腫瘤干細(xì)胞表面抗原（CD44和ALDH-1）、自我更新指標(biāo)（Oct-4和BMI-1）的mRNA表達(dá)呈時(shí)間依賴性下降;0、10、20μM GLA處理肝癌HepG2細(xì)胞72 h后，肝癌HepG2細(xì)胞的腫瘤干細(xì)胞表面抗原(CD44、EpCAM、CD133和CD90)、

7、自我更新指標(biāo)（Oct-4和BMI-1）的mRNA表達(dá)呈劑量依賴性下降;在肝癌Huh-7和MHCC97H細(xì)胞中，GLA同樣抑制CD44和EpCAM的mRNA表達(dá);10μM GLA處理乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞72 h后，側(cè)群細(xì)胞比例、軟瓊脂集落及懸浮球形成數(shù)明顯下降;在肝癌中，20μM GLA抑制HepG2和MHCC97H細(xì)胞軟瓊脂集落形成以及HepG2和Huh-7細(xì)胞懸浮球形成能力。
　　2.TGF-β信號(hào)通路在腫瘤干細(xì)胞樣特

8、性中的作用
　　10 ng/mL TGF-β處理肝癌HepG2細(xì)胞48h，可明顯上調(diào)肝癌HepG2細(xì)胞的干細(xì)胞表面抗原（CD44和EpCAM）的mRNA表達(dá)以及明顯增加軟瓊脂集落和懸浮球形成數(shù)量。
　　用SMAD2-siRNA轉(zhuǎn)染肝癌HepG2細(xì)胞12 h后，再加入10 ng/mL TGF-β處理48 h，發(fā)現(xiàn)TGF-β處理下的肝癌HepG2細(xì)胞的干細(xì)胞表面抗原(CD44和EpCAM)的mRNA表達(dá)下降;軟瓊脂集落形成數(shù)和懸

9、浮球形成數(shù)量均有減少。
　　3.光甘草定對(duì)TGF-β信號(hào)通路的影響
　　10μM GLA處理乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞72h后，再加入10 ng/mL TGF-β處理12h后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GLA降低了TGF-β誘導(dǎo)的p-SMAD2;10μM GLA處理HepG2細(xì)胞72 h后，再加入10 ng/mL TGF-β處理12h后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GLA降低了TGF-β誘導(dǎo)的p-SMAD2及Snail的表達(dá);同時(shí)，GLA抑制了SMAD2

10、總蛋白及mRNA的表達(dá)。
　　用10μM GLA處理乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞0、24、48和72 h后，p-SMAD2及總SMAD2的蛋白及RNA水平呈劑量依賴性降低;在肝癌HepG2細(xì)胞中用0、10或20μM GLA處理HepG2細(xì)胞72 h后，p-SMAD2及總SMAD2的蛋白水平以及SMAD2及其下游Snail mRNA的表達(dá)降低;同時(shí)，GLA抑制了Huh-7和MHCC97H細(xì)胞中SMAD2及Snail mRNA的表達(dá)

11、。
　　4.光甘草定對(duì)miR-148a表達(dá)的影響
　　在MDA-MB-231細(xì)胞中，mimic-148a/WT質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的相對(duì)熒光強(qiáng)度比Con-mimic/WT質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞明顯下降，而mimic-148a/MT質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的相對(duì)熒光強(qiáng)度與Con-mimic/MT質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞相比無(wú)明顯改變。mimic-miR-148a轉(zhuǎn)染肝癌Huh-7細(xì)胞后，miR-148a表達(dá)升高的同時(shí)SMAD2mRNA及蛋白表達(dá)均下降。

12、
　　10μM GLA處理乳腺癌MDA-MB-231和Hs-578T細(xì)胞0、24、48和72 h后，可時(shí)間依賴性上調(diào)miR-148a的表達(dá)。在肝癌HepG2、Huh-7、MHCC97H細(xì)胞中，20μM GLA均可上調(diào)miR-148a的表達(dá)。
　　5.光甘草定對(duì)miR-148a啟動(dòng)子區(qū)甲基化的影響
　　10μM GLA分別處理乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞72 h，qMSP結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GLA處理后miR-148a的甲基化水

13、平下降;同時(shí)，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT1、DNMT3a)表達(dá)受抑制。
　　6.光甘草定通過(guò)miR-148a抑制TGF-β信號(hào)通路
　　在乳腺癌MDA-MB-231、Hs-578T細(xì)胞和肝癌HepG2細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染anti-miR-148a抑制miR-148a的表達(dá)，再加入GLA處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GLA對(duì)miR-148a的上調(diào)作用被削弱，對(duì)SMAD2 mRNA、p-SMAD2及SMAD2總蛋白表達(dá)的抑制作用也被削弱。
　　

14、7.miR-148a在光甘草定抑制腫瘤間質(zhì)特征中的作用
　　在乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中，用anti-miR-148a抑制miR-148a表達(dá)后，可削弱GLA對(duì)Vimentin的抑制作用和對(duì)ZO-1及E-cadherin的上調(diào)作用。
　　8.miR-148a在光甘草定抑制腫瘤干細(xì)胞樣特性中的作用
　　在乳腺癌MDA-MB-231、Hs-578T細(xì)胞和肝癌HepG2、Huh-7細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染anti-miR-148

15、a可阻滯GLA對(duì)腫瘤干細(xì)胞表面抗原(CD44、ALDH-1、EpCAM)的下調(diào)作用，同時(shí)受GLA抑制的側(cè)群細(xì)胞比例、軟瓊脂集落和懸浮球形成數(shù)量重新上調(diào)。
　　9.光甘草定在裸鼠移植瘤模型中調(diào)控腫瘤干細(xì)胞樣特性
　　在裸鼠皮下乳腺癌移植瘤模型中發(fā)現(xiàn)GLA抑制裸鼠移植瘤的生長(zhǎng);乳腺癌腫瘤干細(xì)胞表面抗原（CD44和ALDH-1）和自我更新指標(biāo)（Oct-4和BMI-1）均有不同程度下降;miR-148a的水平明顯上調(diào)，且miR-14