MiR-148a經(jīng)Hedgehog信號(hào)通路誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞自噬與凋亡的研究.pdf

1、第一章：肝星狀細(xì)胞miR-148a靶基因Gas1驗(yàn)證
　　目的：
　　證據(jù)顯示MicroRNAs作為小短鏈非編碼RNAs參與肝纖維化的發(fā)生及發(fā)展，本部分?jǐn)M研究肝星狀細(xì)胞（HSCs）在饑餓誘導(dǎo)狀態(tài)下不同時(shí)點(diǎn)miR-148a及Gas1（生長(zhǎng)阻滯特異基因1）表達(dá)水平的差異并對(duì)miR-148a預(yù)測(cè)的靶基因Gas1進(jìn)行驗(yàn)證，以探討HSCs在應(yīng)激狀態(tài)下miR-148a生物學(xué)特性。
　　方法：
　　永生化HSCs系LX-2及T

2、-6分別經(jīng)EBSS培養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn)后以qRT-PCR檢測(cè)miR-148a及Gas1 mRNA表達(dá)水平差異；經(jīng)生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)miR-148a可能靶基因Gas1 mRNA，并以雙熒光素酶試驗(yàn)系統(tǒng)進(jìn)行驗(yàn)證；最后以miR-148a模擬物及抑制劑通過(guò)脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染LX-2及T-6后經(jīng)Western blot和qRT-PCR法檢測(cè)Gas1蛋白質(zhì)及mRNA表達(dá)水平的變化，以明確miR-148a對(duì)Gas1 mRNA的靶向調(diào)控作用。
　　結(jié)果

3、：
　　MiR-148a在HSCs系LX-2及T-6中表達(dá)水平隨EBSS培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)逐步升高，在培養(yǎng)4 h達(dá)到高峰，且miR-148a表達(dá)與Gas1水平呈負(fù)相關(guān)；生物信息學(xué)方法分析發(fā)現(xiàn)Gas1是miR-148a靶基因之一，在轉(zhuǎn)染克隆野生型Gas13'-UTRs質(zhì)粒實(shí)驗(yàn)組中，經(jīng)雙熒光素酶試驗(yàn)系統(tǒng)檢測(cè)表明miR-148a可與Gas1 mRNA的3'-UTRs結(jié)合，從而抑制雙熒光素酶活性；通過(guò)功能學(xué)研究顯示miR-148a模擬物及抑制

4、劑轉(zhuǎn)染后，與陰性對(duì)照相比，明顯地抑制Gas1蛋白質(zhì)及mRNA表達(dá)水平。
　　結(jié)論：
　　在饑餓誘導(dǎo)狀態(tài)下，LX-2及T-6中miR-148a水平呈現(xiàn)時(shí)間依賴性升高，并靶向抑制Gas1 mRN A表達(dá)，為進(jìn)一步研究 HSCs在自噬誘導(dǎo)狀態(tài)下的生理特性提供新的思路，而miR-148a可能成為肝纖維化治療的新靶點(diǎn)。
　　第二章：Gas1經(jīng)Hedgehog信號(hào)通路抑制肝星狀細(xì)胞自噬
　　目的：
　　生長(zhǎng)阻滯特異基因

5、1（Gas1）是Hed ge ho g信號(hào)通路上游激動(dòng)因子，現(xiàn)已證實(shí)Hed ge ho g信號(hào)通路與細(xì)胞自噬活性關(guān)系密切。本部分?jǐn)M探討Gas1通過(guò)Hedgehog信號(hào)通路調(diào)節(jié)HSCs自噬活性及相應(yīng)分子機(jī)制，為Gas1作為分子靶標(biāo)干預(yù)肝纖維化提供新的思路。
　　方法：
　　分別以0、0.25μg/μl、0.5μg/μl、0.75μg/μl Gas1處理LX-2及T-6細(xì)胞48 h后，通過(guò)Immunoblotting、熒光顯微鏡

6、、透射電鏡檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白、GFP-LC3分布及自噬小體形成；以Hedgehog信號(hào)通路特異性激動(dòng)劑及抑制劑干預(yù)后檢測(cè)Hedgehog通路中關(guān)鍵信號(hào)因子Patch1、Gli1及自噬標(biāo)志蛋白（LC3-II、SQSTM1/p62）表達(dá)水平，以探討Gas1調(diào)節(jié)LX-2及T-6細(xì)胞自噬活性及其可能機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　與陰性對(duì)照組相比，Gas1抑制HSCs自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)呈濃度依賴性，并可抑制自噬小體形成，其中以0.75μg/μ

7、l抑制作用最為顯著；經(jīng)Gas1 siRNA處理后Hedgehog通路關(guān)鍵組分被抑制，但LX-2及T-6細(xì)胞的自噬活性增強(qiáng)；分別以Hed ge ho g通路興奮劑或抑制劑干預(yù)后，再以Gas1處理HSCs，LX-2及T-6細(xì)胞自噬活性明顯減弱或增強(qiáng)。
　　結(jié)論：
　　1. Gas1抑制LX-2及T-6細(xì)胞的自噬活性。
　　2. Gas1抑制HSCs自噬活性通過(guò)促進(jìn)Hedgehog信號(hào)通路傳導(dǎo)實(shí)現(xiàn)。
　　第三章：MiR

8、-148a經(jīng)Gas1誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞自噬，抑制增殖、促進(jìn)凋亡
　　目的：
　　MicroRNAs作為短鏈非編碼 RNAs參與到多種生物學(xué)過(guò)程，已有研究證實(shí) miR-148a在肝纖維化組織及肝癌細(xì)胞中表達(dá)降低，但其對(duì)HSCs自噬活性及生物學(xué)特性的影響目前尚不明確，本部分?jǐn)M探討miR-148a對(duì)HSCs自噬活性及增殖、凋亡的影響，以期為干預(yù)肝纖維化提供新的方向。
　　方法：
　　通過(guò)miR-148a功能獲得與功能喪失實(shí)

9、驗(yàn)以Western blot、熒光顯微鏡、透射電鏡以及自噬抑制劑Bafilomycin al預(yù)處理等實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)HSCs自噬水平改變，以驗(yàn)證miR-148a對(duì)HSCs自噬活性的調(diào)節(jié)作用；并通過(guò)MTS法、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)miR-148a對(duì)HSCs增殖及凋亡影響。
　　結(jié)果：
　　MiR-148a明顯誘導(dǎo)饑餓誘導(dǎo)狀態(tài)下HSCs的自噬活性，表現(xiàn)為促進(jìn)LC3B轉(zhuǎn)換及p62降解，熒光顯微鏡及透射電鏡檢測(cè)表現(xiàn)為免疫熒光蛋白聚集及促進(jìn)自噬小