大鼠膽道梗阻及再通術(shù)后肝臟中PERK表達變化與中藥的作用影響.pdf

1、實驗?zāi)康模?br>　　本研究通過建立SD大鼠梗阻性黃疸模型及膽道梗阻再通模型，探討膽道梗阻后大鼠肝組織中PERK的表達變化，以及梗阻性黃疸再通術(shù)后PERK表達變化與中藥茵陳蒿湯對肝臟的保護作用，為圍手術(shù)期清熱利濕中藥在臨床上的合理應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。
　　實驗方法：
　　選擇128只成年雄性SD大鼠，體重(270-300)g，動物級別為清潔級，隨機分為四組：①梗阻性黃疸組(O組)32只；②假手術(shù)對照組(S組)32只；③梗阻性黃

2、疸再通模型+中藥灌胃組組(ORC)32只；④梗阻性黃疸再通模型+生理鹽水灌胃組(ORW組)32只。S組僅行手術(shù)探查、分離膽管，但不予膽管結(jié)扎，O組先行手術(shù)探查、分離膽管，然后采用雙重線結(jié)扎法建立梗阻性黃疸模型，兩組均于術(shù)后1d、3d、5d、7d[1]，每個時相點處死大鼠8只；ORW組、ORC組借鑒本課題之前造模方法建立膽汁體外引流模型[2]行體外膽道梗阻，并于梗阻后第7天解除梗阻，ORW組、ORC組均于梗阻解除后1d、3d、5d、7d每

3、個時相點處死大鼠8只。留取血液標(biāo)本：檢測比較各組動物血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、總膽紅素(TBIL)、直接膽紅素(DBIL)指標(biāo)含量；留取少量肝臟組織標(biāo)本置于-80℃冰箱保存，應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡法(western blot)測定肝組織中PERK蛋白表達變化，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測大鼠肝組織PERK基因表達情況；剩余肝組織固定于5％中性福爾馬林溶液中，應(yīng)用免疫組化檢測肝組織中PERK蛋白的表達情況

4、，應(yīng)用HE染色法觀察肝組織細(xì)胞水平的病理變化。
　　實驗結(jié)果：
　　1.生化指標(biāo)：S組：術(shù)后第1天時AST、ALT少量升高，但是都處于正常范圍，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；以S組為對照組，O組術(shù)后第1天AST、ALT迅速增高，提示膽總管雙重結(jié)扎法致梗阻性黃疸大鼠模型造模成功；其中AST、ALT均于術(shù)后第1天達到峰值，然后開始下降，自第5天起維持在較高水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。ORW組及ORC組解除梗阻后AST、ALT均呈

5、下降趨勢；以O(shè)RW組為對照，ORC組AST水平在給完中藥后第3、5天數(shù)值均低于ORW組，下降趨勢表現(xiàn)更加明顯(P<0.05)，直至兩組恢復(fù)大致正常水平；ORC組的ALT水平在第1、3天數(shù)值均低于ORW組，下降趨勢也更加明顯(P<0.05)，直至兩組恢復(fù)大致正常水平。S組術(shù)后TBIL、DBIL均無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；與S組比較，O組梗阻后TBIL、DBIL均呈增高趨勢，并于第5、7天后趨于穩(wěn)定(P<0.05)。ORW組及ORC組自

6、解除梗阻后TBIL、DBIL均呈下降趨勢；以O(shè)RW組為對照組，ORC組的下降趨勢更加明顯(P<0.05)。
　　2.肝組織病理：S組肝細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞索排列整齊，未見炎性細(xì)胞浸潤，顯示正常肝小葉結(jié)構(gòu)；O組膽管結(jié)扎后第1天可見匯管區(qū)、肝血竇內(nèi)有淤膽現(xiàn)象，伴少量炎細(xì)胞浸潤，第3天可以發(fā)現(xiàn)細(xì)小膽管增生，第7天可見肝細(xì)胞的壞死灶。解除梗阻后，ORC組及ORW組自第3天起，肝細(xì)胞變性壞死灶減少，肝組織內(nèi)炎性細(xì)胞含量逐漸減少，纖維組織細(xì)胞增

7、生減輕；ORC組肝細(xì)胞在病理學(xué)改變優(yōu)于ORW組。
　　3.采用western blot檢測肝組織中PERK：在蛋白表達水平上，以 GAPDH為內(nèi)參，S組術(shù)后PERK表達不明顯，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；以S組為對照組，O組PERK的表達量緩慢升高，各時相點均出現(xiàn)明顯差異(P<0.05)。解除梗阻后， ORC組及ORW組PERK蛋白的表達量整體上均呈下降趨勢(P<0.05)，并于第7天時達到最低點；以O(shè)RW組為對照組，ORC組PERK的表達

8、量與之比較，各時相點均出現(xiàn)明顯差異(P<0.05)，ORC組PERK表達水平低于ORW組。
　　4.免疫組化檢測肝組織PERK的表達：鏡下可見S組大鼠肝臟內(nèi)表達較少的PERK。與S組相比，隨著造模時間的延長，O組PERK陽性表達量逐漸增加(P<0.05)，主要在細(xì)胞核表達，細(xì)胞漿少量表達。梗阻解除后，ORW組及ORC組PERK蛋白的表達水平整體上均有下降，并于第7天時達到最低；以O(shè)RW組為對照組，ORC組PERK的表達量各時相點均

9、低于ORW組(P<0.05)。
　　5、R-T PCR檢測大鼠肝細(xì)胞中PERK基因：S組PERK mRNA表達水平隨造模時間加長無明顯變化，一直處于低位水平，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。O組PERK mRNA表達水平隨造模時間加長升高；以S組為對照組，O組PERK mRNA表達水平在各個時相點均高于S組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。解除梗阻后， ORC組及ORW組PERK mRNA的表達水平整體上均呈現(xiàn)下降趨勢，并于第7天時達到最低點

10、；以O(shè)RW組為對照組，ORC組PERK mRNA的表達水平在各時相點均表現(xiàn)明顯差異(P<0.05)，ORC組PERK mRNA表達水平低于ORW組。
　　結(jié)論：
　　1.當(dāng)梗阻性黃疸時，隨著造模時間的延長，PERK及PERK mRNA表達水平呈逐漸增加趨勢，且 PERK的表達水平的變化與梗阻性黃疸及膽道再通術(shù)后黃疸程度的高低有顯著的相關(guān)性，這表明在梗阻性黃疸大鼠模型中，存在PERK介導(dǎo)的ERS和細(xì)胞凋亡，且凋亡指數(shù)與黃疸水平

11、的高低顯著相關(guān)。
　　2.梗阻性黃疸大鼠模型解除梗阻后給予中藥茵陳蒿湯可以調(diào)節(jié)PERK mRNA的表達，進而減少因PERK高度表達引起的肝細(xì)胞損傷，改善肝臟因梗阻引起的肝功能異常。梗阻性黃疸時肝損傷程度與 PERK基因表達水平具有相關(guān)性，表明梗阻性黃疸時PERK參與了ERS介導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡。
　　3．針對臨床上梗阻性黃疸患者的圍手術(shù)期治療，合理的手術(shù)方式結(jié)合辯證的選取清熱利濕中藥（茵陳蒿湯）作為輔助療法，可以更好的降低相關(guān)并