PrxⅢ在大鼠肝臟缺血再灌注損傷模型心內(nèi)的表達(dá)變化.pdf

1、肝臟缺血再灌注損傷（hepatic ischemia reperfusion injury，HIRI）是臨床肝臟外科手術(shù)如肝臟移植、肝部分切除等過(guò)程中經(jīng)常遇到的病理生理現(xiàn)象，也是導(dǎo)致肝臟移植失敗，肝臟功能衰竭，病人愈后較差的重要原因。研究證實(shí):缺血再灌注時(shí)可以產(chǎn)生大量的活性氧族(reactive oxygenspecies:ROS)對(duì)肝臟組織細(xì)胞的過(guò)氧化損害是導(dǎo)致HIRI的主要機(jī)制之一。ROS的成員主要包括超氧陰離子(O2-)、過(guò)氧化氫

2、(H2O2)以及羥自由基(OH)等。它們的化學(xué)性質(zhì)非?；顫?，一些重要的胞膜和胞內(nèi)的蛋白（包括結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白）可與其發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)，改變細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，影響細(xì)胞功能，甚至引起細(xì)胞和組織死亡。
　　肝臟是機(jī)體重要的物質(zhì)代謝場(chǎng)所。其功能受損必然引起鄰近或遠(yuǎn)端臟器的代謝和功能異常。心臟是機(jī)體內(nèi)耗氧量大、對(duì)缺血缺氧反應(yīng)非常敏感的臟器之一。當(dāng)阻斷肝臟血液供應(yīng)再恢復(fù)其灌注的過(guò)程中，肝臟處于高度氧化應(yīng)激狀態(tài)，此時(shí)心臟是否也會(huì)遭受過(guò)氧化損傷？有待

3、研究。
　　PrxⅢ是近幾年發(fā)現(xiàn)的一類過(guò)氧化物酶系Peroxiredoxin(Prx)的家族成員之一。研究表明:PrxⅢ是在細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成產(chǎn)生，而后經(jīng)定位信號(hào)定位于線粒體。PrxⅢ是整個(gè)Prx家族中唯一特異性的定位于線粒體內(nèi)的酶蛋白。細(xì)胞內(nèi)的ROS主要來(lái)源于線粒體內(nèi)呼吸鏈的電子泄露。近些年的研究顯示:細(xì)胞線粒體內(nèi)H2O2的清除與PrxⅢ有密切關(guān)聯(lián)。心臟是人體重要器官，其耗氧量非常強(qiáng)大，心肌細(xì)胞的能量供給主要是通過(guò)線粒體的氧化磷

4、酸化。在此過(guò)程中會(huì)有大量ROS生成。因此，心臟是機(jī)體內(nèi)最容易受到ROS過(guò)氧化損傷的器官。在HIRI發(fā)生后，心肌組織PrxⅢ的表達(dá)如何變化，是否參與氧化應(yīng)激反應(yīng)？未見(jiàn)報(bào)道
　　本研究通過(guò)無(wú)損傷血管夾將通往大鼠肝中葉與肝右葉的血管和膽管蒂夾閉，30 min后移開(kāi)血管夾，制造大鼠70％肝臟缺血再灌注損傷模型，然后觀察大鼠血清LDH水平、心肌組織內(nèi)MDA水平，PrxⅢ的mRNA和蛋白表達(dá)水平。探討肝臟缺血再灌注損傷后心肌組織內(nèi)的氧化應(yīng)激狀

5、態(tài)以及 PrxⅢ的抗氧化作用。
　　目的:觀察大鼠肝臟缺血再灌注損傷模型心肌組織內(nèi)的氧化應(yīng)激水平以及PrxⅢmRNA和蛋白表達(dá)水平的改變，探討其在心內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮的作用。
　　方法:
　　1、大鼠肝缺血再灌注損傷模型的制備及取材
　　選用12只雄性健康Wistar大鼠，體重190-210g，于河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)得。隨機(jī)分為肝缺血再灌注損傷組(HIRI)6只，對(duì)照組(Con)6只。6％水合氯醛（自配）

6、按0.5ml/kg計(jì)量，對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔注射，將其麻醉。參照Kohli等人的方法，用玻璃針輕柔分離肝血管和膽管，游離出通往肝中葉和肝右葉的血管和膽管蒂，用無(wú)損傷血管夾將其夾閉。30分鐘后移開(kāi)血管夾，恢復(fù)肝中葉和肝右葉的血液供應(yīng)，制造肝實(shí)質(zhì)70％的肝缺血再灌注損傷模型。對(duì)照組大鼠麻醉后，只游離肝中葉和肝右葉的血管和膽管蒂，30分鐘后關(guān)腹。肝臟恢復(fù)血供6小時(shí)后再次將其麻醉，收集大鼠血液，用于ALT（丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶）和LDH（血清乳酸脫氫酶）

7、的活性測(cè)定;取大鼠肝臟，將其置于4％多聚甲醛溶液中進(jìn)行固定，用HE染色法觀察大鼠肝組織的形態(tài)學(xué)改變;取大鼠心臟，用冰生理鹽水洗去心臟表面和心腔內(nèi)的余血，將心臟置于液氮中用于PrxⅢ mRNA水平、蛋白水平測(cè)定以及MDA含量測(cè)定。
　　2、測(cè)定指標(biāo)及方法
　　2.1 HE染色法觀察大鼠肝臟的形態(tài)結(jié)構(gòu)
　　肝組織經(jīng)常規(guī)梯度乙醇脫水、二甲苯透明，石蠟包埋后，進(jìn)行切片，厚度約5μm，用蘇木精伊紅染色，在日產(chǎn)Olympus光學(xué)顯

8、微鏡下觀察大鼠肝臟組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。
　　2.2大鼠血清中ALT活性的測(cè)定
　　大鼠血液未經(jīng)抗凝處理，3000rpm離心10min后分離血清，用血清ALT全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定其含量。
　　2.3大鼠血清中LDH活性的測(cè)定
　　大鼠血液LDH活性的測(cè)定，按照試劑盒的操作說(shuō)明，采用LD-L速率法測(cè)定。
　　2.4大鼠心肌勻漿的制備以及MDA含量的測(cè)定
　　從-80℃冰箱中取出肝缺血再灌注損傷組及對(duì)照組大

9、鼠的心肌組織，按照10mg/100μl的比例，加入4度勻漿緩沖液(PH7.4，磷酸鉀緩沖液50mmol/L，PMSF1mmol/L，鹽酸苯甲脒1mmol/L，NaCl0.5mol/L，0.1％Tween-20，β-巰基乙醇5mmol/L，EDTANa31 mmol/L)，冰浴中勻漿，4℃勻漿液4000rpm離心20分鐘，取上清即制成10％心組織勻漿，心組織勻漿內(nèi)MDA含量經(jīng)南京建成丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒測(cè)定。
　　2.5大鼠心

10、肌PrxⅢ mRNA水平測(cè)定
　　用TRIzol法提取大鼠心肌RNA。將3μgRNA反轉(zhuǎn)錄生成cDNA。用GAPDH作為內(nèi)參照，進(jìn)行RT-PCR。用PrxⅢ擴(kuò)增產(chǎn)物的灰度值與GAPDH擴(kuò)增產(chǎn)物的灰度值相比，表示目的基因PrxⅢ的相對(duì)表達(dá)量。
　　2.6大鼠心肌PrxⅢ蛋白水平測(cè)定
　　采用Western blotting的方法測(cè)定大鼠心肌內(nèi)PrxⅢ蛋白的相對(duì)表達(dá)量。將-80度冷凍的大鼠心肌組織制成勻漿液，離心后取上清。

11、用改良的Lowry法進(jìn)行蛋白質(zhì)總量測(cè)定。兩組大鼠各心肌樣本蛋白上樣量為68ug。經(jīng)轉(zhuǎn)膜、封閉處理后，在PVDF膜上加入一抗，室溫靜置過(guò)夜。洗膜后，再加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗。按照發(fā)光劑操作說(shuō)明進(jìn)行顯影、定影、晾干。對(duì)膠片進(jìn)行掃描，并做圖像分析，以條帶的灰度值表示其蛋白含量，將PrxⅢ的灰度值與內(nèi)參照GAPDH的灰度值相比，所得即PrxⅢ蛋白的相對(duì)表達(dá)量。
　　結(jié)果:
　　1、大鼠肝臟形態(tài)學(xué)改變
　　在光學(xué)顯微鏡下可

12、見(jiàn)肝缺血再灌注損傷組大鼠的肝組織淤血嚴(yán)重，肝細(xì)胞受壓萎縮，肝血竇擴(kuò)張充血明顯，肝細(xì)胞胞漿內(nèi)有空泡出現(xiàn)并且染色變淺，有部分肝細(xì)胞水腫，染色變淺，體積增大。對(duì)照組大鼠肝細(xì)胞排列整齊成條索狀，圍繞中央靜脈排列成放射狀，肝血竇無(wú)擴(kuò)張充血大小均勻。
　　2、血清ALT水平
　　Con組大鼠血清中ALT為20.03±5.23U/L，而HIRI組血清ALT為87.43±9.06 U/L。HIRI組大鼠血清ALT水平明顯高于Con組(P＜0

13、.01)。
　　3、血清LDH水平
　　Con組大鼠血清中LDH為481.50±67.15U/L，而HIRI組血清LDH為658.83±94.15U/L。HIRI組大鼠血清LDH水平明顯高于Con組（P＜0.01）
　　4、心勻漿內(nèi)MDA的含量
　　Con組大鼠心肌組織MDA的含量為9.24±1.72mmol/g，而HIRI組MDA含量為12.73±1.84 mmol/g。HIRI組大鼠心肌組織MDA的含量明顯高

14、于Con組(P＜0.01)
　　5、大鼠心肌組織PrxⅢ mRNA相對(duì)表達(dá)量
　　大鼠心肌組織中抗氧化物酶--PrxⅢ mRNA的表達(dá)量采用RT-PCR的方法測(cè)定。計(jì)算與內(nèi)參照的比值得出相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行結(jié)果統(tǒng)計(jì)。分析表明:HIRI組大鼠心肌組織的PrxⅢmRNA水平均明顯高于Con組(P＜0.01)。說(shuō)明HIRI組大鼠心肌組織內(nèi)PrxⅢ表達(dá)升高。
　　6、大鼠心肌組織中PrxⅢ蛋白相對(duì)表達(dá)量
　　采用Western

15、 blotting的方法測(cè)定大鼠心肌內(nèi)PrxⅢ蛋白的相對(duì)表達(dá)量。計(jì)算與內(nèi)參照的比值得出相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行結(jié)果統(tǒng)計(jì)。分析表明:HIRI組大鼠心肌中PrxⅢ蛋白的相對(duì)表達(dá)量（0.84±0.18）明顯高于對(duì)照組(0.58±-0.13)(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、結(jié)扎肝右、中血管和膽管蒂可成功建立大鼠肝臟缺血再灌注損傷模型。
　　2、大鼠肝臟缺血再灌注損傷模型血清LDH和心肌組織MDA含量增加，提示:心肌組織已遭受過(guò)氧