EC-SOD在大鼠肝及缺血再灌注損傷中的表達(dá)變化.pdf

1、臨床上在進(jìn)行肝臟手術(shù)如肝臟部分切除、肝臟移植以及處理嚴(yán)重肝臟外傷時(shí)往往需要暫時(shí)性阻斷肝臟血流一段時(shí)間后再重新恢復(fù)其血液供應(yīng)。在這個(gè)過程中就造成了肝臟的缺血再灌注損傷（hepatic ischemiareperfusion injury，HIRI）。HIRI是肝臟外科手術(shù)過程中一種常見的病理生理現(xiàn)象。肝臟的缺血再灌注可引起嚴(yán)重的肝細(xì)胞損傷和肝功能障礙，這也是導(dǎo)致術(shù)后肝功能衰竭和病人預(yù)后較差的重要原因之一。研究已證實(shí)，導(dǎo)致這種損傷的主要機(jī)制

2、之一為氧化應(yīng)激反應(yīng)。缺血再灌注時(shí)機(jī)體會(huì)產(chǎn)生大量活性氧自由基(reac-tive oxygen species，ROS)。ROS包括超氧陰離子(O2-)、羥自由基(OH)和過氧化氫(H2O2)等。ROS的化學(xué)性質(zhì)非?；顫姡梢云茐募?xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、DNA和脂類等生物大分子，引起細(xì)胞死亡。
　　超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutases， SOD)是機(jī)體內(nèi)一種重要的抗氧化酶，負(fù)責(zé)清除O2-，它能將O2-轉(zhuǎn)化成H2O2和氧

3、，在機(jī)體抗氧化應(yīng)激反應(yīng)中具有重要作用。在哺乳動(dòng)物SOD共有三種亞型:Mn-SOD存在于線粒體，Cu/Zn-SOD主要位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。細(xì)胞外超氧化物歧化酶(extracellular SOD，EC-SOD)是唯一位于細(xì)胞外的SOD亞型，并通過其肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(heparin-binding domain，HBD)與細(xì)胞表面和細(xì)胞外基質(zhì)相結(jié)合。其次，EC-SOD也存在于細(xì)胞外液，如血清，腦脊髓液，腹水和滑膜液等。以往對(duì)于SOD的功能研究

4、主要集中在Mn-SOD和Cu/Zn-SOD的抗氧化作用。但最近的研究表明EC-SOD可能具有更強(qiáng)的抗氧化應(yīng)激和抗炎作用。EC-SOD在肝臟缺血再灌注損傷模型的表達(dá)如何變化，是否也發(fā)揮了抗氧化作用，有待證實(shí)。
　　本研究通過無損傷血管夾夾閉通往大鼠肝左葉、肝中葉的血管和膽管蒂30 min后松開血管夾，制造大鼠70％肝臟缺血再灌注損傷模型，6小時(shí)后觀察肝臟組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)改變、MDA含量變化以及EC-SOD mRNA水平和蛋白水平的變化

5、，進(jìn)一步探討缺血再灌注損傷過程中肝臟組織的氧化應(yīng)激狀態(tài)以及EC-SOD的抗氧化作用，為肝臟缺血再灌注損傷的防治提供一條新思路。
　　目的:觀察大鼠肝臟缺血再灌注損傷模型肝組織內(nèi)的氧化應(yīng)激狀態(tài)，觀察EC-SOD的表達(dá)變化，探討其在抗氧化應(yīng)激反應(yīng)中的作用。
　　方法:
　　1動(dòng)物分組及缺血再灌注損傷模型的制備
　　Wister雄性大鼠12只，體重200±10 g，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，隨機(jī)分為兩組:對(duì)照組(

6、Con)和缺血再灌注損傷組(HIRI)，用6％水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠(5ml/kg)，參照Kohli等人的方法，分離肝血管和膽管蒂，以無創(chuàng)傷性血管夾夾閉通往肝左葉、肝中葉的血管和膽管蒂。30分鐘后去掉血管夾，恢復(fù)肝臟血液供應(yīng)，制造70％肝實(shí)質(zhì)的肝臟缺血再灌注損傷模型。對(duì)照組大鼠只分離血管和膽管蒂并不夾閉。6小時(shí)后收集血液，3000rpm離心10min，分離血清，用于ALT（丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶）測(cè)定;處死大鼠取肝臟，一部分4％多聚甲醛中固

7、定進(jìn)行HE染色，觀察肝組織形態(tài)學(xué)改變。一部分置于液氮中用于EC-SOD mRNA水平和蛋白水平檢測(cè)，以及MDA含量測(cè)定
　　2測(cè)定指標(biāo)及方法
　　2.1血清ALT水平測(cè)定
　　血清ALT水平由全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定。
　　2.2 HE染色觀察大鼠肝臟的形態(tài)結(jié)構(gòu)
　　肝組織經(jīng)常規(guī)脫水、透明，石蠟包埋后，切片厚約5μm，蘇木精伊紅染色，日本產(chǎn)Olympus光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織形態(tài)變化并進(jìn)行圖象分析。
　　

8、2.3大鼠肝組織MDA含量測(cè)定
　　將從-70℃冰箱中取出的肝組織按照10mg/100μl加入預(yù)冷的勻漿緩沖液(50mmol/L磷酸鉀緩沖液，PH7.4，1mmol/L鹽酸苯甲脒，1mmol/LPMSF,0.1％Tween-20,0.5mol/L NaCl,1mmol/L EDTANa3,5mmol/Lβ-巰基乙醇），冰浴中勻漿，勻漿液4000rpm4℃離心20min，取上清即制成10％肝組織勻漿，肝組織勻漿內(nèi)MDA含量采用南京建

9、成丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒測(cè)定。
　　2.4大鼠肝組織EC-SOD mRNA水平測(cè)定
　　采用Trizol提取肝組織總RNA。約3μg總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以GAPDH為內(nèi)參照，進(jìn)行RT-PCR。分別以EC-SOD的擴(kuò)增產(chǎn)物與GAPDH灰度值之比表示mRNA的相對(duì)表達(dá)量。
　　2.5大鼠肝組織EC-SOD蛋白水平測(cè)定
　　采用Western blot法測(cè)定大鼠肝組織EC-SOD蛋白水平。將大鼠肝組織制成勻漿

10、，離心后取上清。用改良Lowry法進(jìn)行蛋白總量測(cè)定.電泳的蛋白上樣量為56 ug.經(jīng)過轉(zhuǎn)膜和封閉處理后，在PVDF膜上加入兔抗EC-SOD抗體，室溫靜置過夜。再加入熒光標(biāo)記的抗兔IgG抗體.在雙色紅外線成像系統(tǒng)掃描照相并進(jìn)行圖像數(shù)值分析。
　　結(jié)果:
　　1大鼠肝組織的形態(tài)學(xué)改變
　　光學(xué)顯微鏡下可見Con組大鼠肝細(xì)胞排列成條索狀，圍繞中央靜脈成放射狀排列，肝索間肝血竇大小均勻，無明顯擴(kuò)張充血。而HIRI組大鼠的肝組織

11、淤血嚴(yán)重，肝血竇明顯擴(kuò)張充血，肝細(xì)胞受壓萎縮，部分肝細(xì)胞胞漿染色變淺，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)空泡變性且空泡數(shù)量較多，但壞死不明顯。
　　2血清ALT水平測(cè)定
　　Con組大鼠血清中ALT為20.03±5.23U/L，而HIRI組血清ALT為87.43±9.06U/L。HIRI組大鼠血清ALT水平明顯高于Con組(P＜0.01)。
　　3肝漿內(nèi)MDA的含量
　　Con組大鼠肝勻漿內(nèi)的MDA含量為8.72±1.53mmol/g，

12、而HIRI組肝勻漿內(nèi)的MDA含量為12.75±2.25 mmol/g。HIRI組大鼠肝勻漿內(nèi)的MDA含量明顯高于Con組（P＜0.01）。
　　4肝組織EC-SOD mRNA的相對(duì)表達(dá)量
　　采用RT-PCR的方法測(cè)定大鼠肝組織內(nèi)EC-SOD mRNA的相對(duì)表達(dá)量。Con組肝組織內(nèi)EC-SOD mRNA的相對(duì)表達(dá)量為0.68±0.11，HIRI肝組織內(nèi)EC-SOD mRNA的相對(duì)表達(dá)量為1.13±0.18，HIRI組大鼠肝組

13、織內(nèi)EC-SOD mRNA水平明顯高于Con組(P＜0.01)。說明HIRI組大鼠肝組織內(nèi)EC-SOD的基因表達(dá)水平升高。
　　5大鼠肝組織EC-SOD蛋白水平
　　Con組大鼠肝組織內(nèi)EC-SOD的蛋白表達(dá)水平為0.74±0.14，HIRI組大鼠肝組織內(nèi)EC-SOD的蛋白表達(dá)水平為1.10±0.22。HIRI組EC-SOD蛋白水平明顯高于對(duì)照組(P＜0.01)。說明HIRI組大鼠肝組織內(nèi)EC-SOD的蛋白表達(dá)水平升高。