EC-SOD在大鼠肝缺血再灌注損傷模型肺內(nèi)的表達(dá)變化.pdf

1、肝臟作為機(jī)體內(nèi)最大的腺體，不僅參與了糖類、脂類、蛋白質(zhì)等物質(zhì)的代謝，還具有排泄、分泌、生物轉(zhuǎn)化等重要功能。因此，當(dāng)肝臟功能出現(xiàn)損傷時，不僅機(jī)體內(nèi)的物質(zhì)代謝會發(fā)生紊亂，其他重要器官的功能也會出現(xiàn)障礙。臨床上的肝臟手術(shù)如肝臟移植、肝部分切除術(shù)等的實施過程中均需要暫時性阻斷肝臟的血液供應(yīng)，但當(dāng)其血液供應(yīng)被重新恢復(fù)時即會發(fā)生肝缺血再灌注損傷（hepatic ischemia reperfusion injury，HIRI）。因此， HIRI已成

2、為臨床肝臟外科治療過程中的主要并發(fā)癥。它的發(fā)生也是引發(fā)肝臟手術(shù)患者出現(xiàn)手術(shù)失敗、肝功能衰竭，以及術(shù)后愈后較差的主要原因。
　　實驗研究表明，肝臟被阻斷的血供被重新恢復(fù)時即會有大量活性氧族（reactive oxygen species：ROS)的產(chǎn)生，高活性分子ROS對肝臟組織細(xì)胞引發(fā)的過氧化損害是導(dǎo)致HIRI發(fā)生的主要機(jī)制之一。ROS的成員主要包括超氧陰離子（O2-.）,過氧化氫（H2O2）和羥自由基(OH.)等。ROS能與細(xì)胞

3、內(nèi)的重要蛋白質(zhì)、酶、核酸、細(xì)胞骨架及脂質(zhì)物質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致線粒體功能障礙和胞膜結(jié)構(gòu)受損，甚至組織和細(xì)胞的死亡。肺臟是機(jī)體內(nèi)對氧氣供應(yīng)量和缺氧狀態(tài)非常敏感的臟器。在缺血再灌注氧氣供應(yīng)量發(fā)生變化時，肺臟是否也會發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，遭受過氧化損傷？
　　超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutases，SOD）是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化酶之一，它能催化O2-氧化生成氧和H2O2。因此，SOD是清除O2-的重要酶蛋白，在機(jī)體內(nèi)的抗

4、過氧化過程具有重要作用。哺乳動物體內(nèi)共有三中SOD亞型：在線粒體內(nèi)以錳作為輔基的錳-超氧化物歧化酶（Mn-SOD），在細(xì)胞胞漿中以銅和鋅作為輔基的銅鋅超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)。細(xì)胞外超氧化物歧化酶（extracellular SOD, EC-SOD)是機(jī)體內(nèi)唯一位于細(xì)胞外的SOD亞型，它依靠自身的肝素結(jié)合域( heparin-binding domain, HBD)能與細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞表面結(jié)合。以往眾多的抗氧化功能研究主要集

5、中于Cu/Zn-SOD和Mn-SOD。但也有實驗研究發(fā)現(xiàn)：細(xì)胞外的EC-SOD在機(jī)體內(nèi)的抗氧化應(yīng)激和抗炎反應(yīng)中可能發(fā)揮了更重要的作用。HIRI可引起其他臟器的損傷，包括遠(yuǎn)隔臟器心、腦、肺等。這些遠(yuǎn)隔臟器的損傷與炎癥、氧化應(yīng)激、凋亡等密切相關(guān)。EC-SOD在肺臟組織內(nèi)大量表達(dá)，在HIRI發(fā)生后，肺組織遭受損傷時，肺組織內(nèi)的抗氧化酶EC-SOD基因和蛋白表達(dá)如何變化，在缺血再灌注后是否發(fā)揮了抗氧化應(yīng)激作用，有待研究。
　　本研究通過阻

6、斷大鼠肝左葉、肝中葉的血管和膽管蒂再重新恢復(fù)其灌注的方法制造大鼠HIRI模型，然后測定大鼠肺組織內(nèi)的MDA和H2O2水平變化，以及EC-SOD的mRNA和蛋白表達(dá)改變。探討HIRI發(fā)生后肺組織內(nèi)的氧化應(yīng)激狀態(tài)以及EC-SOD在此過程中的抗氧化應(yīng)激作用。
　　目的：
　　觀察大鼠HIRI模型肺組織內(nèi)的MDA水平、H2O2水平以及抗氧化酶EC-SOD的基因和蛋白表達(dá)水平變化，探討HIRI發(fā)生后肺組織內(nèi)的氧化應(yīng)激狀態(tài)以及EC-SO

7、D在此過程中可能發(fā)揮的抗氧化作用。
　　方法：
　　1、大鼠HIRI模型的制備及標(biāo)本處理
　　選用體重190-210g健康雄性Wistar大鼠12只，實驗動物均購于河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物。將大鼠隨機(jī)分為HIRI組（6只），Conrol組（6只）。采用自配的6％水合氯醛（0.5ml／kg）對大鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉。按照Kohli等人的實驗方法，用自制的手術(shù)玻璃針小心分離膽管和肝血管，分離出通往肝左葉和肝中葉的血管以及膽管蒂，

8、并采用無損傷血管夾夾閉。夾閉30分鐘后撤去血管夾，重新恢復(fù)肝中葉和肝左葉的血液灌注，制造70%的肝實質(zhì)HIRI模型。Conrol組大鼠被麻醉后，只分離通往肝中葉和肝左葉的血管及膽管蒂，30分鐘后關(guān)閉大鼠腹腔?；謴?fù)肝臟血液供應(yīng)6小時后再次重新將其麻醉，首先收集大鼠血液，用于血清 ALT（丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶）和MDA含量檢測；取大鼠肝臟和肺臟，將肝臟置于4%多聚甲醛溶液中固定，采用HE染色法觀察大鼠肝組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變；將大鼠肺臟置于液氮中，

9、用于抗氧化酶 EC-SOD的基因水平和蛋白水平檢測，以及肺組織內(nèi)MDA含量和H2O2含量檢測。
　　2、測定指標(biāo)及檢測方法
　　2.1、 HE染色觀察大鼠肝臟形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變
　　肝組織經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明，石蠟包埋處理后，進(jìn)行切片，切片厚度約5μm，采用蘇木精伊紅進(jìn)行染色， Olympus光學(xué)顯微鏡觀察大鼠肝臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化。
　　2.2、大鼠血清ALT活性檢測
　　收集的大鼠血液未進(jìn)行抗凝處理，

10、靜置30分鐘后，3000rpm離心10min，收集血清，采用全自動生化分析儀測定ALT活性。
　　2.3、大鼠血清MDA含量檢測
　　大鼠血清內(nèi)MDA含量采用南京建成丙二醛(MDA)測定試劑盒測定。
　　2.4、大鼠肺組織勻漿制備以及MDA含量檢測
　　從-80℃冰箱中取出HIRI組和Control組大鼠肺組織，按照10mg/100μl的處理比例，加入4℃勻漿緩沖液(PH7.4，磷酸鉀緩沖液50mmol/L， P

11、MSF1mmol/L，鹽酸苯甲脒1mmol/L，NaCl0.5mol/L，0.1%Tween-20，β-巰基乙醇5mmol/L，EDTANa31mmol/L)，冰浴下進(jìn)行勻漿處理，勻漿液于4℃，4000rpm離心20分鐘，收集上清即制成10％肺組織勻漿，勻漿內(nèi)MDA含量采用南京建成丙二醛(MDA)測定試劑盒進(jìn)行檢測。
　　2.5、大鼠肺組織H2O2含量檢測
　　將從-80℃冰箱中取出的肺組織按照10mg/100μl比例加入預(yù)

12、冷的勻漿緩沖液(50mmol/L磷酸鉀緩沖液，PH7.4，1mmol/L鹽酸苯甲脒，1mmol/L PMSF，0.1%Tween-20，0.5mol/L NaCl,1mmol/L EDTANa3，5mmol/Lβ-巰基乙醇)，冰浴下進(jìn)行勻漿處理，勻漿液于4℃，4000rpm離心20分鐘，收集上清即制成10％肺組織勻漿。肺組織勻漿內(nèi)H2O2含量采用鉬酸比色法進(jìn)行檢測，以每克樣本蛋白所含H2O2量(mmol/g pro)表示肺組織H2O2含

13、量。
　　2.6、大鼠肺組織EC-SOD mRNA表達(dá)水平檢測
　　采用 TRIzol試劑提取大鼠肺組織總 RNA，并反轉(zhuǎn)錄生成 cDNA。GAPDH作為內(nèi)參照，RT-PCR法測定EC-SOD mRNA表達(dá)水平。EC-SOD擴(kuò)增產(chǎn)物的灰度值與內(nèi)參照GAPDH擴(kuò)增產(chǎn)物灰度值之比，表示目的基因EC-SOD的相對表達(dá)水平。
　　2.7、大鼠肺組織EC-SOD蛋白表達(dá)水平檢測
　　采用免疫印跡法測定大鼠肺組織EC-SOD

14、的蛋白表達(dá)水平。將-80度冷凍的大鼠肺組織制成勻漿液,離心后取上清，并做蛋白變性處理。蛋白總量采用改良 Lorry法進(jìn)行測定。電泳蛋白上樣量為62ug。經(jīng)過電泳、轉(zhuǎn)膜及封閉處理后,在 PVDF膜上加入兔抗 EC-SOD一抗,室溫靜置過夜。經(jīng)過洗膜處理后，加入抗兔IgG二抗（辣根過氧化物酶標(biāo)記）。按發(fā)光試劑操作指導(dǎo)先后進(jìn)行顯影、定影、晾干處理。掃描膠片并進(jìn)行圖像分析， EC-SOD灰度值與內(nèi)參照GAPDH灰度值之比表示目的蛋白的相對表達(dá)水

15、平。
　　結(jié)果：
　　1、大鼠肝臟組織HE染色形態(tài)學(xué)觀察
　　奧林巴斯光學(xué)顯微鏡下，對照組大鼠肝組織切片顯示：肝細(xì)胞排列整齊形成條索狀，圍繞在中央靜脈周圍成放射狀排列，肝血竇大小均勻未見擴(kuò)張充血。肝缺血再灌注損傷組大鼠肝組織切片顯示：肝細(xì)胞有受壓萎縮現(xiàn)象，并且淤血嚴(yán)重，肝血竇擴(kuò)張充血比較明顯，肝細(xì)胞的胞漿內(nèi)有空泡出現(xiàn)，HE染色變淺，可見部分肝細(xì)胞水腫，體積有所增大。
　　2、大鼠血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性改變

16、r>　　對照組大鼠血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶為20.03±5.23U/L，而肝缺血再灌注損傷組大鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶為87.43±9.06 U/L。肝缺血再灌注損傷組大鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶水平明顯高于對照組（P<0.01）。
　　3、大鼠血清中丙二醛含量變化
　　對照組大鼠血清中丙二醛的含量為12.69±2.29 umol/L，肝缺血再灌注損傷組大鼠血清中丙二醛的含量為17.54±1.96 umol/L。肝缺血再灌注損傷組大

17、鼠血清丙二醛含量明顯高于對照組（P<0.01）。
　　4、大鼠肺勻漿內(nèi)丙二醛含量變化
　　HIRI組大鼠肺內(nèi)丙二醛含量（14.09±2.47 mmol/g）明顯高于對照組大鼠肺內(nèi)丙二醛含量（9.81±1.89mmol/g， P<0.01）
　　5、肺勻漿內(nèi)H2O2含量變化
　　HIRI組大鼠肺內(nèi)H2O2含量（19.52±3.03 mmol/g）明顯高于Con組大鼠肺內(nèi)H2O2含量（13.39±1.97mmol/g

18、）（P<0.01）。
　　6、肺組織內(nèi)EC-SOD mRNA表達(dá)量的變化
　　以GAPDH作為內(nèi)對照，采用RT-PCR的方法測定大鼠肺組織內(nèi)抗氧化酶 EC-SOD mRNA表達(dá)量的改變。HIRI組大鼠肺組織內(nèi)的 EC-SOD mRNA水平（0.91±0.13）明顯高于Con組（0.49±0.08）（P<0.01）。此結(jié)果說明HIRI組大鼠肺組織內(nèi)EC-SOD表達(dá)明顯升高。
　　7、大鼠肺組織內(nèi)EC-SOD的蛋白表達(dá)水平

19、
　　大鼠肺組織內(nèi)細(xì)胞外-超氧化物歧化酶（EC-SOD）的蛋白相對表達(dá)量，采用Western blotting方法測定。將其內(nèi)參照GAPDH的比值作為其相對表達(dá)量，然后進(jìn)行結(jié)果統(tǒng)計。數(shù)據(jù)表明：對照組大鼠肺組織中 EC-SOD的蛋白相對表達(dá)量（0.71±0.12）明顯低于肝缺血再灌注損傷組的相對表達(dá)量（1.09±0.18）（P<0.01），也表明大鼠肺組織內(nèi)EC-SOD表達(dá)明顯增強(qiáng)。
　　結(jié)論：
　　1、大鼠肝臟缺血再灌