梗阻性黃疸大鼠血清對肝細(xì)胞模型IRE1表達(dá)的影響與中藥的作用機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　通過研究不同血清干預(yù)后大鼠正常肝細(xì)胞中 IRE1α的表達(dá)變化，探討梗阻性黃疸肝損傷的發(fā)生機(jī)制及中藥茵陳蒿湯對肝細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制，為臨床上梗阻性黃疸患者使用清熱利濕中藥提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　1、選擇30只成年雄性SD大鼠，體重(270-300)g，動(dòng)物級別為清潔級，隨機(jī)分為三組：①梗阻性黃疸組(O組)10只；②假手術(shù)對照組(S組)10只；③茵陳蒿湯灌胃組（Y組）10只。S組僅行手術(shù)探查、分離膽管，但不

2、予膽管結(jié)扎，O組先行手術(shù)探查、分離膽管，然后采用雙重線結(jié)扎法建立梗阻性黃疸模型，Y組采用茵陳蒿湯灌胃（每次劑量1mL/100g體重），三組均于術(shù)后5d經(jīng)腹主動(dòng)脈取血，部分血液標(biāo)本：檢測比較各組動(dòng)物血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、總膽紅素(TBIL)、直接膽紅素(DBIL)指標(biāo)含量；其余血液標(biāo)本離心后保留血清備用。
　　2、選取大鼠正常肝細(xì)胞系BRL-3A，購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。分為A、B、C三組，其中①A組為加入

3、含正常大鼠血清的培養(yǎng)基；②B組為加入含梗阻性黃疸大鼠血清的培養(yǎng)基；③C組為加入含梗阻性黃疸大鼠血清及茵陳蒿湯灌胃大鼠血清的培養(yǎng)基。分別于6h、24h、48h取材，離心后取肝細(xì)胞及培養(yǎng)液上清。分別標(biāo)記為A6h、A24h、A48h、B6h、B24h、B48h、C6h、C24h、C48h。肝細(xì)胞應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡法(western blot)測定肝組織中IRE1α蛋白表達(dá)變化，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測大鼠肝組織 IRE1α基

4、因表達(dá)情況；培養(yǎng)液上清測量ALT、AST含量。
　　結(jié)果：
　　1、生化指標(biāo)：①動(dòng)物實(shí)驗(yàn)造模取血清部分：O組TBIL、DBIL、ALT、AST值較正常值明顯升高，分別S組對比均明顯升高，差異都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），大鼠梗阻性黃疸模型建立成功。②細(xì)胞實(shí)驗(yàn)部分培養(yǎng)液測定 ALT、AST：以 A組為對照組，B組及C組的ALT、AST水平在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的均高于A組（P<0.05）；與B比較，C組的ALT、AST水平在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)

5、的均低于B組（P<0.05）。
　　2、采用western blot檢測大鼠肝細(xì)胞中IRE1α：在蛋白表達(dá)水平上，以Actin為內(nèi)參。以A組為對照組，B組及C組的IRE1α表達(dá)水平在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的均高于A組（P<0.05）；與B比較，C組的IRE1α表達(dá)水平在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的均低于B組（P<0.05）。
　　3、R-T PCR檢測大鼠肝細(xì)胞中IRE1αmRNA基因：以A組為對照組，B組及C組的IRE1αm-RNA表達(dá)水平在各個(gè)時(shí)間

6、點(diǎn)的均高于A組（P<0.05）；與B比較，C組的IRE1αm-RNA表達(dá)水平在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的均低于B組（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1、正常大鼠肝細(xì)胞培養(yǎng)過程中加入梗阻性黃疸大鼠血清能夠成功制造肝損傷模型。由IRE1α-JNK介導(dǎo)ERS途徑的肝細(xì)胞凋亡，是梗阻性黃疸引起肝損傷的可能機(jī)制。
　　2、正常大鼠肝細(xì)胞梗阻性黃疸肝損傷模型中加入茵陳蒿湯含藥血清仍能改善肝功能，可能是通過抑制IRE1α蛋白的過度激活，從而降低