腫瘤壞死因子-α抗體對梗阻性黃疸大鼠腎功能的影響及其機制的研究.pdf

1、梗阻性黃疸(obstructive jaundice,OJ)是指排泄膽汁的膽道系統(tǒng)因機械性的梗阻,致使膽汁無法順暢地排泄到腸道所引起的黃疸。梗阻性黃疸一般需要手術(shù)治療,其術(shù)后約11％患者會產(chǎn)生腎功能衰竭,死亡率約32％-100％[1].
　　 腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)是一種促炎性細(xì)胞因子,TNF-α主要是由內(nèi)毒素刺激單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生。梗阻性黃疸時受內(nèi)毒素刺激單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)產(chǎn)

2、生大量的TNF-α[2],又因為血清中的TNF-α主要在肝臟清除,梗阻性黃疸時肝臟受到損傷使其清除TNF-α的能力大大下降,這導(dǎo)致TNF-α在肝內(nèi)處于較高的水平,Bemelmans[2]通過試驗測定梗阻性黃疸大鼠血液循環(huán)中的TNF-α明顯高于對照組,過多的TNF-α?xí)?dǎo)致肝、腎功能的損傷。
　　 有研究發(fā)現(xiàn)[3,4,5]:TNF-α可增強腎小球前小動脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)的1,4,5-三磷酸肌醇受體(inositol1,4,5-trip

3、hosphate receptor,IP3R)的表達(dá),并可增加細(xì)胞外鈣內(nèi)流。OJ時腎損害的發(fā)生與TNF-α增強腎小球前小動脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)的IP3R的表達(dá),從而增加細(xì)胞外鈣內(nèi)流,致使腎皮質(zhì)血流量減少有關(guān)。本研究擬采用膽總管結(jié)扎致梗阻性黃疸大鼠模型,并通過腹腔內(nèi)注射腫瘤壞死因子-α單克隆抗體,病理學(xué)觀察OJ大鼠腎臟形態(tài)學(xué)改變,通過Western blot和免疫組織化學(xué)方法檢測IP3R在腎組織的含量和表達(dá);來研究TNF-α單克隆抗體對梗阻性黃

4、疸大鼠腎功能的影響及其機制。為臨床治療OJ所致腎損害提供理論依據(jù)。
　　 目的:通過膽總管結(jié)扎(common bile duct ligation,CBDL)制作梗阻性黃疸大鼠模型,并腹腔內(nèi)注射腫瘤壞死因子-α單克隆抗體,研究抑制TNF-α表達(dá)后腎臟功能和形態(tài)的變化和IP3R在腎組織表達(dá)的變化。
　　 方法:將60只雄性Sprague Dawley大鼠隨機分成假手術(shù)組(sham組)、模型組(分為CBDL術(shù)后1week、2

5、week、3week、4week和5week五個亞組)和干預(yù)組(分為CBDL術(shù)后1week干預(yù)1week、2week、3week和4week四個亞組)。模型組分別于結(jié)扎后1wk、2wk、3wk、4wk、5wk麻醉動物,干預(yù)組于結(jié)扎后第2周開始腹腔注射腫瘤壞死因子-α單克隆抗體(0.1mg/kg/2d),并于干預(yù)后1wk、2wk、3wk、4wk麻醉動物,sham組與5wk模型組動物同批麻醉,留取肝、腎組織、血標(biāo)本。采用肝臟HE染色和Mas

6、son三色染色,腎臟HE染色確定模型建立情況,并與干預(yù)組與模型組對比;采用生化方法檢測肝、腎功能變化,通過Western blot方法檢測IP3R的含量;免疫組織化學(xué)方法檢測IP3R在腎組織的表達(dá)。用單因素方差分析和SNK-q檢驗統(tǒng)計分析。
　　 結(jié)果:
　　 1肝臟及腎臟病理改變
　　 肝臟組織HE及Masson染色顯示:sham組HE染色顯示肝小葉結(jié)構(gòu)完整,肝板排列整齊;Masson三色染色僅在門管區(qū)可見少量

7、結(jié)締組織。CBDL組肝臟小膽管廣泛增生,膽管擴張,纖維組織增生,假小葉形成。干預(yù)組大鼠HE染色顯示肝臟小葉結(jié)構(gòu)變化不明顯,小膽管仍有增生;Masson染色顯示門管區(qū)膠原纖維輕微增多,未見假小葉形成。
　　 腎組織HE染色顯示:sham組:腎小球體積形態(tài)正常,腎小管上皮細(xì)胞排列規(guī)整,腎臟未見明顯病理改變,僅見少量結(jié)締組織。CBDL組:造模2周時腎細(xì)胞腫脹,腎間質(zhì)可見少量炎性細(xì)胞浸潤,未見明顯壞死灶,可見黃色顆粒,結(jié)締組織明顯增多;

8、造模5周組腎小管上皮細(xì)胞腫脹,排列不規(guī)整,水樣空泡變性、脫落,同時可見局灶上皮細(xì)胞壞死,胞漿崩解,間質(zhì)有大量炎性細(xì)胞浸潤,結(jié)締組織增生更加明顯。干預(yù)組大鼠腎臟病變較CBDL組明顯減輕,炎性細(xì)胞浸潤明顯減少,間質(zhì)充血未見,結(jié)締組織較模型組略少。
　　 2肝功能檢測:
　　 造模1周后,CBDL組血漿ALT明顯增高,與sham組比較有明顯差異(P＜0.05)。之后雖逐漸下降,但均明顯高于sham組。TNF-α單克隆抗體干預(yù)治

9、療后1周即較同周CBDL組明顯下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),之后呈下降趨勢,至治療后4周仍高于sham組,但是差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 3腎功能檢測:
　　 CBDL組在CBDL術(shù)后血漿CREA逐漸上升,于第三周達(dá)到峰值之后逐漸下降,但均明顯高于假手術(shù)組(P＜0.05)。TNF-α單克隆抗體干預(yù)治療后與同周CBDL組比較CREA水平明顯下降(P＜0.05),但仍高于sham組(治療2周組P＜0.

10、05,之后P＞0.05)。
　　 血漿BUN在CBDL術(shù)后造模組明顯升高,與sham組有明顯差異(P＜0.05)。TNF-α單克隆抗體干預(yù)治療后較同周CBDL組明顯下降(P＜0.05),但仍明顯高于sham組(治療2周組P＜0.05,之后P＞0.05)。
　　 4內(nèi)毒素檢測:
　　 CBDL組造模術(shù)后1周起,血漿內(nèi)毒素水平顯著升高,之后在此水平波動,3周時有所下降,但仍顯著高于sham組(P＜0.05)。5周時又

11、回升至術(shù)后1W水平。TNF-α單克隆抗體干預(yù)治療后1周血漿內(nèi)毒素水平開始明顯下降,且較同周CBDL組明顯降低(P＜0.05),之后逐漸下降,但仍顯著高于sham組(治療4周時P＜0.05,之后P＞0.05)。
　　 5血漿TNF-α檢測:
　　 CBDL術(shù)后1周血漿TNF-α水平即明顯升高,之后呈上升趨勢,3周時血漿TNF-α水平達(dá)高峰,4周時有所回落,5周又開始回升,但均明顯高于sham組(P＜0.05)。TNF-α單

12、克隆抗體干預(yù)治療后1周即開始明顯降低,之后繼續(xù)下降,但仍高于同周sham組(治療4周時P＜0.05,之后P＞0.05)。
　　 6腎組織IP3R的表達(dá)
　　 免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示,CBDL組腎組織IP3R蛋白表達(dá)較多,可見棕褐色的陽性顆粒主要集中于腎小球系膜細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的胞漿內(nèi),與sham組有顯著差異(P＜0.05)。TNF-α單克隆抗體干預(yù)后IP3R蛋白表達(dá)下降,與CBDL組比較,表現(xiàn)為陽性著色變少,但均明顯高于s

13、ham組(P＜0.05)。
　　 Western blot分析在260KD的位置上出現(xiàn)雜交帶,從雜交信號強度可知,CBDL術(shù)后造模組2周腎組織IP3R蛋白表達(dá)即開始明顯增加,與sham組有明顯差異(P＜0.05)。至4周達(dá)高峰,之后又下降,并在一定范圍波動。TNF-α單克隆抗體干預(yù)治療后2周開始明顯下降,與同周CBDL組有顯著性差異(P＜0.05),之后在一定范圍波動;與sham組比較差異也較明顯(P＜0.05)。