GRP78在大鼠膽道梗阻及再通術(shù)后肝臟組織中表達(dá)變化和中藥的干預(yù)作用研究及臨床觀察.pdf

1、目的：
　　本研究通過建立SD大鼠梗阻性黃疸模型及梗阻再通模型，觀察梗阻性黃疸時(shí)GRP78在大鼠肝組織中的表達(dá)變化及其意義；探討梗阻性黃疸再通術(shù)后GRP78表達(dá)變化及中藥茵陳蒿湯對(duì)肝臟的保護(hù)作用，以及茵陳蒿湯用于因膽管結(jié)石導(dǎo)致梗阻性黃疸術(shù)后的臨床療效觀察。
　　方法：
　　1、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
　　選擇成年雄性SD大鼠128只，體重(270-300)g，動(dòng)物級(jí)別為清潔級(jí)，將大鼠隨機(jī)分為四組：（1）假手術(shù)對(duì)照組(S組)32

2、只；（2）梗阻性黃疸組(O組)32只；（3）梗阻性黃疸再通模型+生理鹽水灌胃組(OM組)32只；（4）梗阻性黃疸再通模型+中藥灌胃組(ON組)32只。S組與O組于術(shù)后1、3、5、7D,每時(shí)相點(diǎn)處死大鼠8只，OM組與ON組均于梗阻7天后解除梗阻,并于解除梗阻后1、3、5、7D每個(gè)時(shí)相點(diǎn)處死大鼠8只。留取血液標(biāo)本及肝臟組織，檢測血清中TBIL、ALT、AST等生化指標(biāo)含量；另取肝組織固定于5％中性福爾馬林溶液，石蠟包埋，5μm切片行HE染色

3、觀察肝組織的病理改變，并免疫組化檢測肝組織GRP78的表達(dá)；剩余肝組織經(jīng)液氮速凍后置于-80℃冰箱，用western blot測肝組織中GRP78蛋白表達(dá)變化；用Real-Time PCR檢測大鼠肝組織GRP78基因表達(dá)量情況。
　　2、臨床研究
　　選擇符合診斷標(biāo)準(zhǔn)的梗阻性黃疸患者60例，隨機(jī)分為常規(guī)西醫(yī)治療對(duì)照組(簡稱對(duì)照組)30例，常規(guī)西醫(yī)治療基礎(chǔ)上加服茵陳蒿湯治療組(簡稱治療組)30例。對(duì)照組為常規(guī)純西醫(yī)治療，治療組

4、采取西醫(yī)常規(guī)處理的基礎(chǔ)上給予茵陳蒿湯，其中茵陳蒿湯送我院中藥房煎煮，每次服用100ml，每日2次溫服，服用5天。觀察兩組血清總膽紅素，谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶變化情況。
　　結(jié)果：
　　1、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
　　1.1 血清生化指標(biāo)的變化
　　S組術(shù)后第1天ALT、AST有輕度升高，但是都處于正常值范圍，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與S組比較，O組術(shù)后第1天就出現(xiàn)ALT、AST迅速增高；其中ALT、AST均于術(shù)后第1天達(dá)到峰值，然后

5、開始下降，自第3天起維持在較高水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。OM組及ON組解除梗阻后AST均呈下降趨勢，與OM組比較，ON組在給完中藥后第3、5天數(shù)值均低于OM組，下降趨勢表現(xiàn)更加明顯(P<0.05)，直至兩組均恢復(fù)大致正常水平；ON組的ALT水平在第1、3天數(shù)值均低于OM組，下降趨勢也更加明顯(P<0.05)，直至兩組恢復(fù)大致正常水平。S組術(shù)后TBIL、DBIL均無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與S組比較，O組梗阻后TBIL、

6、DBIL均呈增高趨勢，并于第5、7天后趨于穩(wěn)定(P<0.05)。OM組及ON組再通后TBIL、DBIL均顯著下降，ON組各個(gè)時(shí)相點(diǎn)均低于OM組，下降趨勢更明顯(P<0.05)。
　　1.2 肝組織病理學(xué)改變
　　S組肝細(xì)胞無腫脹、壞死，肝細(xì)胞索排列整齊，未見炎性細(xì)胞浸潤，顯示正常肝小葉結(jié)構(gòu)；O組膽管結(jié)扎后第1天可見匯管區(qū)、肝血竇內(nèi)有淤膽現(xiàn)象，少量炎性細(xì)胞胞浸潤，第3天可見細(xì)小膽管和無管腔的小膽管增生，第7天可見少量肝細(xì)胞的壞

7、死灶。OM組及ON組在解除梗阻后3天開始，隨著時(shí)間的延長，肝組織內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤逐漸減少，纖維組織細(xì)胞增生明顯減輕，肝細(xì)胞變性壞死灶減少。ON組肝細(xì)胞在解除梗阻病理學(xué)改變優(yōu)于OM組。
　　1.3 Real-Time PCR檢測大鼠肝組織GRP78mRNA基因表達(dá)量情況
　　S組GRP78mRNA表達(dá)水平隨造模時(shí)間加長無明顯變化，一直處于低位水平，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。O組GRP78mRNA表達(dá)水平隨造模時(shí)間加長升高，5天時(shí)達(dá)到最高

8、點(diǎn)，隨后下降，與S組比較，O組GRP78mRNA表達(dá)水平在各個(gè)時(shí)相點(diǎn)均高于S組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。OM組及ON組解除梗阻后GRP78mRNA的表達(dá)水平均有下降，7天時(shí)達(dá)到最低點(diǎn)；以O(shè)M組為對(duì)照組，ON組GRP78mRNA的表達(dá)水平在各時(shí)相點(diǎn)均表現(xiàn)明顯差異(P<0.05)，ON組GRP78mRNA表達(dá)水高于OM組。
　　1.4 免疫組化檢測肝組織GRP78的表達(dá)
　　鏡下可見S組大鼠肝臟內(nèi)表達(dá)較少的GRP78。

9、隨著造模時(shí)間的延長，O組GRP78陽性表達(dá)量逐漸增加，5天時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)，隨后下降，主要表達(dá)于肝細(xì)胞胞漿內(nèi)，與S組比較P<0.05。OM組及ON組解除梗阻后GRP78蛋白的表達(dá)量均有下降，7天時(shí)達(dá)到最低點(diǎn)；與OM組相比，ON組GRP78的表達(dá)量各時(shí)相點(diǎn)均高于OM組(P<0.05)。
　　1.5 采用western blot檢測肝組織中GRP78表達(dá)變化
　　在蛋白表達(dá)水平上，以GAPDH為內(nèi)參，S組術(shù)后GRP78表達(dá)不明顯，且

10、差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義了；以S組為對(duì)照組，O組GRP78的表達(dá)量升高，5天時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)，隨后下降，各時(shí)相點(diǎn)均出現(xiàn)明顯差異(P<0.05)。OM組及ON組解除梗阻后GRP78蛋白的表達(dá)量均有下降，7天時(shí)達(dá)到最低點(diǎn)；以O(shè)M組為對(duì)照組，ON組GRP78的表達(dá)量與之比較，各時(shí)相點(diǎn)均出現(xiàn)明顯差異(P<0.05)，ON組GRP78表達(dá)水平高于OM組。
　　2、臨床研究
　　在研究中，測定30例治療組和30例對(duì)照組患者手術(shù)前后血清TBIL，AL

11、T及AST。術(shù)后兩組梗阻性黃疸患者血清TBIL、ALT及AST同術(shù)前相比均有所下降，低于術(shù)前1 d測定值，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。治療組梗阻性黃疸患者術(shù)后血清TBIL， ALT及AST均低于對(duì)照組同期觀察值，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　1、梗阻性黃疸形成初期因啟動(dòng)了非折疊蛋白反應(yīng)，GRP78及GRP78mRNA表達(dá)上調(diào)，但隨著梗阻時(shí)間延長，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)出現(xiàn)功能障礙，保護(hù)機(jī)制失代償，GRP78

12、及GRP78mRNA表達(dá)下降，肝細(xì)胞凋亡增加，這表明在梗阻性黃疸大鼠模型中，存在GRP78介導(dǎo)的ERS。
　　2、梗阻性黃疸大鼠模型解除梗阻后給予中藥茵陳蒿湯可以使GRP78mRNA的表達(dá)上調(diào)，可能發(fā)揮了GRP78抵抗細(xì)胞凋亡作用保護(hù)機(jī)制，改善肝臟因梗阻引起的肝功能異常。表明梗阻性黃疸大鼠模型解除梗阻后給予中藥茵陳蒿湯可以調(diào)節(jié)GRP78 mRNA的表達(dá)。
　　3、茵陳蒿湯對(duì)膽管結(jié)石術(shù)后黃疸的消退和肝臟功能的恢復(fù)起到了一定的促