人抗氧化基因TXN1和GLRX2的克隆、測序與表達.pdf

1、環(huán)境污染,尤其是紫外線照射、化學(xué)物質(zhì)、電離輻射、壓力、吸煙、酒精、農(nóng)藥、食物添加劑等外來因素均能促使人體內(nèi)產(chǎn)生大量的自由基。自由基在身體的各個地方每天以1011的數(shù)量不斷形成,一旦不能很快地被捕獲,就會引起機體功能紊亂。自由基能攻擊和氧化控制細胞生長和發(fā)育的遺傳物質(zhì)DNA,由此增加患癌癥的可能性、促進多種疾病的不良發(fā)展和導(dǎo)致過早衰老。
　　前期自由基氧化損傷的研究發(fā)現(xiàn),生物體內(nèi)的氧化還原系統(tǒng)(Reduction-oxidation

2、 system，redox system)存在著氫受體與氫供體,其中典型的氧化還原系統(tǒng)有:硫氧還蛋白/硫氧還蛋白還原酶(Trx/Trx reductase)、脫嘌呤/脫嘌呤內(nèi)切核酸酶(Apurinic/apyrimidinic endonuclease)、鐵氧還蛋白/鐵氧還蛋白還原酶(Ferredoxin/ferrdoxin reductase)、谷氧還蛋白(Glutarrdoxin，Grx)、催化生物體內(nèi)二硫化物構(gòu)象的蛋白質(zhì)(DsbA

3、)等,它們對生物體內(nèi)氧化還原狀態(tài)有著重要的調(diào)節(jié)作用。
　　而目前已知的細胞內(nèi)復(fù)雜二硫化物還原的系統(tǒng)主要有硫氧還蛋白系統(tǒng)(Thioredoxin system)和谷氧還蛋白系統(tǒng)(Glutaredoxin system)。前者包括NADPH、硫氧還蛋白(Thioredoxin，Trx)和硫氧還蛋白還原酶(Thioredoxin reductase，TR),后者包括還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)、谷胱甘肽(Glutathi

4、one，GSH)、谷胱甘肽還原酶(Glutathione reductase，GR)和谷氧還蛋白(Glutaredoxin，Grx)。
　　筆者選取了同時存在于細胞核內(nèi)的Trx1和Grx2作為整體進行研究,通過GENE BANK查找TXN1和GLRX2基因序列,設(shè)計引物,在人HeLa細胞cDNA文庫中通過PCR技術(shù)對其進行擴增,初步鑒定后構(gòu)建重組質(zhì)粒,然后對質(zhì)粒DNA進行測序鑒定,最后構(gòu)建真核表達載體并在哺乳動物CHO細胞中表達基

5、因TXN1和GLRX2,得到表達蛋白Trx1和Grx2,并對蛋白進行了鑒定。
　　主要取得如下成果:
　　1、成功從HeLa細胞中擴增出目的基因TXN1和GLRX2.
　　2、成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pCMV–Tag3-TXN1和pCMV–Tag3-GLRX2.
　　3、對TXN1和GLRX2進行序列測定,序列結(jié)果正確。
　　4、成功構(gòu)建真核表達載體并在哺乳動物CHO細胞中高效表達了基因TXN1和GLRX2,得到表

6、達蛋白Trx1和Grx2.
　　與其它系統(tǒng)相比,哺乳動物細胞表達系統(tǒng)的優(yōu)勢在于能夠指導(dǎo)蛋白質(zhì)的正確折疊,提供復(fù)雜的N型糖基化和準確的O型糖基化等多種翻譯后加工功能,因而表達產(chǎn)物在分子結(jié)構(gòu)、理化特性和生物學(xué)功能方面最接近于天然的高等生物蛋白質(zhì)分子。
　　蛋白在活體內(nèi)的功能涉及多層次多元化的調(diào)控過程,整個機體是一個精細的調(diào)控系統(tǒng)。因此構(gòu)建真核表達載體,獲得由哺乳動物細胞翻譯后再加工修飾產(chǎn)生的外源蛋白質(zhì)對于后續(xù)的研究工作具有非常重