家蠅MdDpt和MdAtt-2基因的克隆與表達(dá).pdf

1、抗菌肽是一類具有抗菌活性的小分子多肽，是生物體免疫系統(tǒng)的重要組分。家蠅（Musca domestica）生活在細(xì)菌橫生的惡劣環(huán)境中，表現(xiàn)出很強(qiáng)的適應(yīng)能力，這是因?yàn)槠渥陨砭哂休^為完善的免疫系統(tǒng)，形成了抵御外來有害微生物入侵的防御機(jī)制。
　　 本論文以家蠅為研究材料，研究內(nèi)容主要分為3個(gè)部分：
　　 第1部分：通過RT-PCR及RACE技術(shù)從家蠅幼蟲體內(nèi)克隆獲得2 種不同的抗菌肽基因的cDNA序列，根據(jù)同源分析，將其分別命名

2、為：家蠅雙翅肽（Musca domesticaDiptericin，MdDpt）和家蠅攻擊素-2（Musca domestica Attacin-2，MdAtt-2），并對(duì)其蛋白質(zhì)序列進(jìn)行了分析；
　　 第2 部分：以家蠅β-actin基因作為內(nèi)參分子，利用半定量RT-PCR對(duì)經(jīng)大腸桿菌（Escherichia coli）刺激后MdDpt和MdAtt-2基因的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行相對(duì)定量研究；
　　 第3 部分：構(gòu)建了家

3、蠅MdDpt和MdAtt-2基因的原核表達(dá)載體，并在大腸桿菌DE3體內(nèi)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，以純化后的DsbA-MdDpt融合蛋白免疫新西蘭大白兔制備了抗血清。
　　 研究結(jié)果：
　　 （1）得到一條全長410bp的家蠅MdDpt基因cDNA序列，包含一個(gè)300bp的完整開放閱讀框（ORF），根據(jù)ORF推導(dǎo)的MdDpt 多肽由99個(gè)氨基酸殘基組成，SignalP3.0 程序預(yù)測n端包括20個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽，MdDpt成熟肽由

4、79個(gè)氨基酸殘基組成，理論分子量為8.79kD，理論等電點(diǎn)為8.27。同源性分析表明，它與廄蠅（Stomoxyscalcitrans）的Diptericin A mRNA相似性最高（identity=74％）。
　　 （2）MdAtt-2基因cDNA 序列其全長809bp，編碼區(qū)長726bp，根據(jù)ORF推導(dǎo)的MdAtt-2多肽由241個(gè)氨基酸殘基組成，SignalP 3.0程序預(yù)測N 端包括22個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽，MdAtt-

5、2成熟肽由219個(gè)氨基酸殘基組成，理論分子量為23.63kD，理論等電點(diǎn)為9.77。同源性分析表明，氨基酸與棕尾別麻蠅（Sarcophaga peregrina）的Sarcotoxin IIA 具有最高相似性（identity=45％）。
　　 （3）半定量RT-PCR分析：數(shù)據(jù)分析表明在未經(jīng)誘導(dǎo)的家蠅幼蟲體內(nèi)2個(gè)基因的表達(dá)量均很低，經(jīng)過大腸桿菌（E. Coli）刺激后2個(gè)基因表達(dá)量迅速上調(diào)，在12h后達(dá)到高峰，隨后逐漸恢復(fù)，7

6、2h后趨于恢復(fù)向正常水平，通過t 檢驗(yàn)，2個(gè)基因的表達(dá)量在6~72h后均高于未刺激的對(duì)照組，且具有顯著性差異（P<0.01）。
　　 （4）利用高效原核表達(dá)載體pET-DsbA，成功實(shí)現(xiàn)了MdDpt和MdAtt-2基因在大腸桿菌DE3中的融合表達(dá)，IPTG終濃度為0.8mmol/L。SDS-PAGE蛋白電泳顯示，獲得的融合蛋白DsbA-MdDpt分子量約為33kD，融合蛋白DsbA-MdAtt-2分子量約為48kD，目的條帶大小