皺紋盤鮑抗氧化基因的克隆及其在營(yíng)養(yǎng)調(diào)控下表達(dá)的研究.pdf

1、皺紋盤鮑(Haliotis discus hannai Ino)隸屬于軟體動(dòng)物門，腹足綱(Gastropoda)，前腮亞綱(Prosobranchia)，原始腹足目(Archaeogastropoda)，鮑科(Haliotidae)，主要分布在我國(guó)渤海和黃海，以及日本和朝鮮的附近海域，是世界重要的名貴海水養(yǎng)殖品種。但是近年來(lái)由于環(huán)境污染、操作不當(dāng)、投飼頻率增加等原因，使得養(yǎng)殖的皺紋盤鮑不斷發(fā)生各類病害，其產(chǎn)量大幅度下跌，種質(zhì)出現(xiàn)衰退現(xiàn)象

2、。而環(huán)境中各種脅迫因子的增加和鮑魚(yú)免疫力的下降直接導(dǎo)致病原體的高感染率和鮑魚(yú)的高死亡率。但時(shí)至今日，皺紋盤鮑的先天性免疫學(xué)研究中仍然存在大量的空白，尤其是如何利用皺紋盤鮑的營(yíng)養(yǎng)免疫機(jī)制來(lái)提高其免疫力的研究較少。所以深入開(kāi)展皺紋盤鮑營(yíng)養(yǎng)免疫機(jī)制研究并在此基礎(chǔ)上尋找增加皺紋盤鮑抗脅迫能力的有效方法已成為當(dāng)務(wù)之急。
　　 研究發(fā)現(xiàn)，在受到病原體、化學(xué)因子、輻射、溫度(高溫或者低溫)變化、溶解氧、營(yíng)養(yǎng)不良以及其他可能的脅迫條件下，水生生

3、物體會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧分子。這些活性氧分子能夠消滅掉外源入侵者，但同時(shí)由于活性氧分子反應(yīng)的非特異性，它們也會(huì)對(duì)宿主的細(xì)胞、組織和器官造成嚴(yán)重傷害，進(jìn)而導(dǎo)致皺紋盤鮑生理機(jī)能的損傷和免疫系統(tǒng)的破壞。所以，消除皺紋盤鮑體內(nèi)因過(guò)度免疫反應(yīng)產(chǎn)生的過(guò)量氧自由基將能夠增強(qiáng)其抵御病原侵染的能力，提高免疫力。為了維持機(jī)體健康，避免活性氧對(duì)自身細(xì)胞造成損傷，阻止由于氧化脅迫引起的疾病和死亡，耗氧生物體在長(zhǎng)期的氧脅迫環(huán)境以及外界生存環(huán)境中形成了一個(gè)行之有效的

4、抗氧化體系，以維持體內(nèi)產(chǎn)生適量ROS和清除多余ROS之間的平衡，進(jìn)而維持動(dòng)物機(jī)體內(nèi)氧化和抗氧化之間的動(dòng)態(tài)平衡。其中，包括抗氧化酶系統(tǒng)，如：谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPx)、超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)等，以及非酶類抗氧化分子，如硒結(jié)合蛋白、鐵蛋白、熱休克蛋白、維生素C和谷胱甘肽等。
　　 眾所周知，生物體內(nèi)自由基的產(chǎn)生、清除、利用、損傷及其修復(fù)所需物質(zhì)與能量均直接或間接來(lái)源于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及其代謝物，即動(dòng)物體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)素及其

5、代謝物是各類自由基產(chǎn)生的物質(zhì)來(lái)源；清除自由基系統(tǒng)的成分均直接或間接來(lái)自營(yíng)養(yǎng)素與膳食中抗氧化劑。因此，營(yíng)養(yǎng)狀況應(yīng)能維持自由基的產(chǎn)生與清除處于正常動(dòng)態(tài)平衡，內(nèi)環(huán)境處于穩(wěn)定的還原態(tài)，并使各類活性氧的生理作用以及彼此相互作用能正常發(fā)揮。此外，大量研究已經(jīng)證明動(dòng)物體能夠通過(guò)營(yíng)養(yǎng)調(diào)控的方式獲得更好的氧化還原平衡，如通過(guò)獲得適量的硒、鋅、鐵和維生素C等。然而，尚未有關(guān)于營(yíng)養(yǎng)素和皺紋盤鮑抗氧化系統(tǒng)在基因轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行相互作用研究的報(bào)道。此外，克隆和鑒定

6、抗氧化反應(yīng)相關(guān)基因?qū)?huì)幫助我們更好的理解對(duì)于營(yíng)養(yǎng)調(diào)控的分子生物學(xué)機(jī)制。
　　 在本研究中，我們首先對(duì)皺紋盤鮑氧化還原平衡系統(tǒng)中的硒依賴型谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(Se-GPX)，硒結(jié)合蛋白(SEBP)，熱休克蛋白90(HSP90)和鐵蛋白(FT)等進(jìn)行了基因全長(zhǎng)克隆，并對(duì)其分子結(jié)構(gòu)特征、組織分布特征及其在營(yíng)養(yǎng)(硒、鐵和鋅)調(diào)控下的表達(dá)特征進(jìn)行了相關(guān)分析。此外，我們還應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)，對(duì)經(jīng)過(guò)維生素C調(diào)控下的皺紋盤鮑抗氧化相關(guān)基因(

7、Cu/Zn-SOD，Mn-SOD，CAT，GPX，GST，Tpx，SEBP，HSP26，HSP70和HSP90)和氧化脅迫相關(guān)基因(NF-KB)進(jìn)行了相對(duì)定量的表達(dá)分析。
　　 1.皺紋盤鮑谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的基因克隆及其在飼料中不同濃度硒、鋅和鐵元素處理下的表達(dá)分析
　　 以皺紋盤鮑(Haliotis discus hannai Ino)(平均體長(zhǎng)：65.01±0.45 mm)為材料，利用同源克隆技術(shù)和RACE技術(shù)從皺

8、紋盤鮑肝臟中成功擴(kuò)增出中硒依賴型谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(selenium-dependent glutathione peroxidase，HdhGPx)。HdhGPx全長(zhǎng)為963bp(Genbank中的注冊(cè)號(hào)為GU254066)，包括21bp的5’非編碼區(qū)、273 bp的3’非編碼區(qū)和669 bp的開(kāi)放閱讀框。另外，在3’非編碼區(qū)還存在一個(gè)101bp的SECIS作用原件。其中HdhGPx的開(kāi)放閱讀框編碼222個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量約為24.

9、76 KDa，理論等電點(diǎn)為7.00；在其N端含有一個(gè)23個(gè)氨基酸殘基編碼的信號(hào)肽。在HdhGPx的cDNA序列中含有一個(gè)典型的終止密碼子(235TGA237)用于編譯硒半胱氨酸(U72)，一個(gè)GPx信號(hào)基序2(96LGLPCNQF103)，一個(gè)GPx活化位點(diǎn)基序(179WNFEKF184)。此外，在HdhGPx的氨基酸序列中還存在兩個(gè)潛在的蛋白質(zhì)糖基化位點(diǎn)(112NGTE115和132NLTQ135)。在三維空間結(jié)構(gòu)上，HdhGPx顯示

10、出與人GPx3具有更高的結(jié)構(gòu)相似性。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，HdhGPx mRNA在肝臟、外套膜、鰓、性腺、肌肉和腎臟中的表達(dá)量要顯著高于在血細(xì)胞中的表達(dá)量，而且在肝臟中的表達(dá)量為最高。通過(guò)分別用不同濃度的微量元素硒(0.15 mg/kg，1.32 mg/kg和48.7 mg/kg)、鋅(6.69mg/kg，33.85 mg/kg和710.63 mg/kg)和鐵(29.19 mg/kg，65.7 mg/kg和1267.2 mg/

11、kg)的飼料來(lái)飼喂幼鮑(平均體長(zhǎng)：13.05±0.25 mm)20周后，分別取其肝臟和血細(xì)胞總RNA，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行HdhGPx mRNA的表達(dá)分析。分析結(jié)果顯示，在硒處理組，皺紋盤鮑肝胰臟中HdhGPx mRNA的表達(dá)量隨硒添加量增加而升高。皺紋盤鮑肝胰臟中HdhGPx mRNA的表達(dá)量在硒添加量為1.32 mg/kg時(shí)表達(dá)量最高，但皺紋盤鮑血細(xì)胞中HdhGPx mRNA的表達(dá)量在硒過(guò)量組(48.7 mg/kg)為最高

12、。在鋅處理組，皺紋盤鮑肝胰臟中HdhGPx mRNA的表達(dá)量升高，但是在鋅添加量為33.85mg/kg達(dá)到最高。在鐵處理組，皺紋盤鮑HdhGPx mRNA的表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，即在鐵適量組(65.7 mg/kg)為最高，而后在鐵過(guò)量組(1267.2 mg/kg)肝胰臟中HdhGPx的表達(dá)量降低。上述研究結(jié)果表明HdhGPx的表達(dá)受到飼料中微量元素(硒、鋅和鐵)添加量的影響，而且可能在提高機(jī)體抗氧化能力和防止由微量元素含量過(guò)高引

13、起的氧化脅迫中擔(dān)負(fù)重要作用。
　　 2.皺紋盤鮑硒結(jié)合蛋白的基因克隆及其在飼料中不同濃度硒、鋅和鐵元素處理下的表達(dá)分析
　　 利用同源克隆技術(shù)和RACE技術(shù)從皺紋盤鮑肝臟中成功擴(kuò)增出中硒結(jié)合蛋白(selenium-binding protein，HdhSEBP)。HdhSEBP全長(zhǎng)為2071 bp(Genbank中的注冊(cè)號(hào)為GU014544)，包括55bp的5’非編碼區(qū)、522 bp的3’非編碼區(qū)和1494 bp的開(kāi)放閱

14、讀框。其中HdhSEBP的開(kāi)放閱讀框編碼497個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量約為55.6 KDa，理論等電點(diǎn)為5.47。BLAST分析結(jié)果顯示HdhSEBP與其他物種，如哺乳動(dòng)物、鳥(niǎo)、魚(yú)和無(wú)脊椎動(dòng)物的SEBP氨基酸序列具有高度的相似性。此外，HdhSEBP的氨基酸序列中還存在多個(gè)金屬結(jié)合位點(diǎn)和一個(gè)潛在的蛋白質(zhì)糖基化位點(diǎn)(320NKTV323)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，HdhSEBP mRNA在外套膜、腎臟、肝臟和血細(xì)胞中的表達(dá)量要顯著高于

15、在鰓、性腺和肌肉中的中的表達(dá)量，而且以在外套膜中的表達(dá)量為最高。通過(guò)分別用不同濃度的微量元素硒(0.15 mg/kg，1.32 mg/kg和48.7 mg/kg)、鋅(6.69 mg/kg，33.85 mg/kg和710.63 mg/kg)和鐵(29.19 mg/kg，65.7 mg/kg和1267.2mg/kg)的飼料來(lái)飼喂幼鮑(最初體長(zhǎng)：13.05±0.25 mm)20周后，分別取其肝臟和血細(xì)胞總RNA，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)

16、行HdhSEBP mRNA的表達(dá)分析。分析結(jié)果顯示，在硒處理組，皺紋盤鮑肝胰臟中HdhSEBP mRNA的表達(dá)量隨硒添加量增加而升高。皺紋盤鮑肝胰臟和血細(xì)胞中HdhSEBP mRNA在硒添加量為1.32 mg/kg時(shí)表達(dá)量均為最高水平。在鋅處理組，皺紋盤鮑肝胰臟和血細(xì)胞中HdhSEBP mRNA在鋅添加量為33.85 mg/kg時(shí)表達(dá)量均為最高，但是在鋅添加量為710.63 mg/kg降低到最低水平。在鐵處理組，皺紋盤鮑HdhSEBP

17、mRNA的表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，即在鐵適量組(65.7 mg/kg)為最高，而后在鐵過(guò)量組(1267.2 mg/kg)中HdhSEBP的表達(dá)量降低。上述研究結(jié)果表明HdhSEBP的表達(dá)受到飼料中微量元素(硒、鋅和鐵)添加量的影響，而且可能在提高機(jī)體抗氧化能力和防止由微量元素含量過(guò)高引起的氧化脅迫中擔(dān)負(fù)重要作用。
　　 3.皺紋盤鮑熱休克蛋白90的基因克隆及其在飼料中不同濃度硒、鐵和鋅元素處理下的表達(dá)分析
　　 以

18、皺紋盤鮑(Haliotis discus hannai Ino)(平均體長(zhǎng)：65.01±0.45 mm)為材料，利用同源克隆技術(shù)和RACE技術(shù)從皺紋盤鮑肝臟中成功擴(kuò)增出中熱休克蛋白90(heatshock protein90，HdhHSP90)。HdhHSP90全長(zhǎng)為2660 bp(Genbank中的注冊(cè)號(hào)為GU014545)，包括96 bp的5’非編碼區(qū)、377 bp的3’非編碼區(qū)和2187 bp的開(kāi)放閱讀框。其中HdhHSP90的開(kāi)

19、放閱讀框編碼728個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量約為84.134 KDa，理論等電點(diǎn)為4.619。BLAST分析結(jié)果顯示HdhHSP90與其他物種，如哺乳動(dòng)物、鳥(niǎo)、魚(yú)和無(wú)脊椎動(dòng)物的HSP90氨基酸序列具有高度的同源性。在HdhHSP90氨基酸序列中含有6個(gè)典型的熱休克蛋白家族的信號(hào)基序(NKEIFLRELISNSSDALDKIR，LGTIAKSGT，IGQFGVGFYSAYLVAE，IKLYVRRVFI，GVVDSEDLPLNISRE，MEEVD

20、)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，HdhHSP90 mRNA在性腺和血細(xì)胞中的表達(dá)量較高。通過(guò)分別用不同濃度的微量元素硒(0.15 mg/kg，1.32 mg/kg和48.7mg/kg)、鋅(6.69 mg/kg，33.85 mg/kg和710.63 mg/kg)和鐵(29.19 mg/kg，65.7 mg/kg和1267.2 mg/kg)的飼料來(lái)飼喂幼鮑(最初體長(zhǎng)：13.05±0.25 mm)20周后，分別取其肝臟和血細(xì)胞總RNA。

21、熒光定量PCR分析結(jié)果顯示，在硒處理組，皺紋盤鮑肝胰臟中HdhHSP90 mRNA的表達(dá)量隨硒添加量增加而升高。皺紋盤鮑肝胰臟和血細(xì)胞中HdhHSP90 mRNA在硒添加量為1.32 mg/kg時(shí)表達(dá)量均為最高水平。在鋅處理組，皺紋盤鮑肝胰臟和血細(xì)胞中HdhHSP90 mRNA在鋅添加量為33.85 mg/kg時(shí)表達(dá)量均為最高，但是在鋅添加量為710.63 mg/kg降低到最低水平。在鐵處理組，皺紋盤鮑HdhHSP90 mRNA的表達(dá)量

22、呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，即在鐵適量組(65.7 mg/kg)為最高，而后在鐵過(guò)量組(1267.2 mg/kg)中HdhHSP90的表達(dá)量降低。上述研究結(jié)果表明HdhHSP90的表達(dá)受到飼料中微量元素(硒、鋅和鐵)添加量的影響，而且可能在提高機(jī)體抗脅迫能力和保護(hù)動(dòng)物機(jī)體免受由飼料中微量元素(硒、鋅和鐵)含量過(guò)高引起的氧化脅迫中擔(dān)負(fù)重要作用。
　　 4.皺紋盤鮑鐵蛋白的基因克隆及其在飼料中不同濃度鐵元素處理下的表達(dá)分析
　　

23、 利用文庫(kù)構(gòu)建技術(shù)和RACE技術(shù)從皺紋盤鮑肝臟中成功擴(kuò)增出中一個(gè)新型的鐵蛋白(ferritin，HdhNFT)。HdhNFT全長(zhǎng)為915bp(Genbank中的注冊(cè)號(hào)為GU479917)，包括103 bp的5’非編碼區(qū)、296 bp的3’非編碼區(qū)和516 bp的開(kāi)放閱讀框。其中HdhNFT的開(kāi)放閱讀框編碼171個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量約為19.8.KDa，理論等電點(diǎn)為4.79。BLAST分析結(jié)果顯示HdhNFT與其他物種，如哺乳動(dòng)物、鳥(niǎo)、魚(yú)

24、和無(wú)脊椎動(dòng)物的FT氨基酸序列具有高度的相似性。此外，HdhNFT的氨基酸序列中還存在一個(gè)潛在的蛋白質(zhì)糖基化位點(diǎn)(27NCSY30)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，HdhNFTmRNA在腎臟、肝臟、鰓、肌肉和外套膜和血細(xì)胞中的表達(dá)量要顯著高于在性腺和血細(xì)胞中的中的表達(dá)量，而且以在腎臟中的表達(dá)量為最高。通過(guò)用不同濃度的微量元素鐵(29.19 mg/kg，65.7 mg/kg，1267.2 mg/kg和6264.7 mg/kg)的飼料來(lái)飼喂

25、幼鮑(最初體長(zhǎng)：13.05±0.25 mm)20周后，分別取其肝臟和血細(xì)胞總RNA，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行HdhSEBP mRNA的表達(dá)分析。分析結(jié)果顯示，皺紋盤鮑HdhNFT mRNA的表達(dá)量呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)，即隨鐵添加量的增加，在鐵過(guò)量組(6264.7mg/kg)中HdhNFT的表達(dá)量最高。上述研究結(jié)果表明HdhNFT的表達(dá)受到飼料中鐵元素添加量的影響，而且可能在提高機(jī)體抗氧化能力和防止由鐵元素含量過(guò)高引起的氧化脅迫中擔(dān)負(fù)重要

26、作用。
　　 5.飼料中添加維生素C對(duì)皺紋盤鮑肝胰腺中抗氧化和脅迫相關(guān)基因表達(dá)的影響
　　 本研究以皺紋盤鮑(Haliotis discus hannai Ino)(平均體長(zhǎng)：84.36±0.24 mm)為研究對(duì)象，探討飼料中添加不同梯度維生素C對(duì)皺紋盤鮑肝胰腺組織中抗氧化脅迫相關(guān)基因(超氧化物歧化酶，SOD；過(guò)氧化氫酶，CAT；谷胱甘肽過(guò)氧化物酶，GPX；谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶，GST；硒結(jié)合蛋白，SEBP；熱休克蛋白2

27、6，HSP26；熱休克蛋白70，HSP70；熱休克蛋白90，HSP90)以及細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子Rel/NF-KB等在轉(zhuǎn)錄水平上表達(dá)的影響。通過(guò)用添加了不同濃度維生素C(0.0 mg/kg，70.3 mg/kg，829.8 mg/kg和4967.5 mg/kg)的飼料來(lái)飼喂皺紋盤鮑成鮑，在室內(nèi)流水系統(tǒng)養(yǎng)殖24周后，取其肝臟總RNA，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行相關(guān)基因的表達(dá)水平的分析。分析結(jié)果顯示，與基礎(chǔ)飼料組相比，飼料中添加適量的維生素C

28、(70.3 mg/kg)能夠顯著提高皺紋盤鮑肝胰腺中抗氧化相關(guān)基因(Cu/Zn-SOD，CAT，GST，NFT，HSP26)mRNA的表達(dá)量，但是顯著降低Mn-SOD，GPX，TPX和SEBP mRNA的表達(dá)量。與添加適量的維生素C(70.3 mg/kg)飼料組相比，添加過(guò)量的維生素C(829.8 mg/kg和4967.5mg/kg)顯著提高皺紋盤鮑肝胰腺中Mn-SOD，GPX，TPx，SEBP，NFT，HSP70，HSP90和NF-K

29、B mRNA的表達(dá)量。上述研究結(jié)果表明飼料中維生素C能夠影響皺紋盤鮑抗氧化脅迫相關(guān)基因的表達(dá)量，這提示飼料中添加適量的維生素C能夠提高機(jī)體抗氧化能力，減輕機(jī)體內(nèi)的氧化脅迫程度。但是飼料中添加過(guò)量的維生素C會(huì)起到氧化劑的作用，從而降低皺紋盤鮑機(jī)體的抗脅迫能力。
　　 總體而之，飼料中添加適量的微量元素(硒、鋅和鐵)或抗氧化劑(維生素C)能夠顯著提高皺紋盤鮑抗氧化相關(guān)基因的表達(dá)量，進(jìn)而提高機(jī)體的抗氧化脅迫的能力。而過(guò)量的微量元素(硒