依達(dá)拉奉對(duì)1-溴丙烷誘導(dǎo)大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的保護(hù)作用.pdf

1、研究目的：
　　1-溴丙烷（1-bromopropane，1-BP）是一種揮發(fā)性有機(jī)溶劑，其半衰期短，對(duì)臭氧層破壞作用小，是氟氯烴類等臭氧層破壞物質(zhì)的替代劑，廣泛用于精密儀器清洗，目前也常替代有潛在致癌危險(xiǎn)的干洗劑用于干洗行業(yè)。隨著1-BP使用量和生產(chǎn)量的日益增多，暴露人群逐漸擴(kuò)大，近年來(lái)國(guó)內(nèi)外不斷有1-BP神經(jīng)中毒的病例報(bào)道，中毒病人一般首先表現(xiàn)出中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)受損癥狀如頭疼

2、、頭暈、記憶障礙、焦慮或抑郁等，并逐漸出現(xiàn)周圍神經(jīng)系統(tǒng)(peripheral nervous system，PNS)損傷癥狀如四肢麻木、下肢振動(dòng)覺(jué)減弱，嚴(yán)重者表現(xiàn)為共濟(jì)失調(diào)，甚至癱瘓。1-BP的神經(jīng)毒性與其他有機(jī)溶劑神經(jīng)中毒表現(xiàn)出明顯不同，中毒病例和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察到1-BP引起的CNS損傷表現(xiàn)明顯。由于1-BP神經(jīng)毒性的確切機(jī)制尚不明確，臨床上目前也無(wú)特異有效的治療措施。先前的研究顯示1-BP的神經(jīng)毒性與其導(dǎo)致大腦的氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)密切

3、相關(guān)。依達(dá)拉奉(edaravone，EDA)為3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮，因其具有較強(qiáng)的清除自由基和抗炎作用，自2001年起在臨床上用于缺血性腦血管病再灌注引起的氧化損傷治療。因此，在本實(shí)驗(yàn)中，采用1-BP誘導(dǎo)1-BP中樞神經(jīng)毒性，并給予不同劑量的EDA進(jìn)行干預(yù)，通過(guò)Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物認(rèn)知功能變化，檢測(cè)大腦線粒體活性，以及大腦氧化應(yīng)激和炎性狀態(tài)，觀察了1-BP的CNS毒性和EDA的保護(hù)作用，探討1-BP的神經(jīng)

4、毒性機(jī)制和尋找有效干預(yù)靶點(diǎn)。
　　研究方法：
　　1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和處理: SPF級(jí)雄性Wistar大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3d后，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、1-BP模型組、1-BP+1 mg/kg.bwEDA組、1-BP+3 mg/kg.bw EDA組、1-BP+5mg/kg.bw EDA組和5 mg/kg.bw EDA對(duì)照組，每組12只。1-BP采用玉米油稀釋，經(jīng)灌胃途徑給予，劑量均為800mg/kg.bw。EDA均在1-BP染毒后4h

5、經(jīng)腹腔注射給予。對(duì)照組分別按1-BP和EDA給予方式給予等體積的溶劑。
　　2.Morris水迷宮試驗(yàn):實(shí)驗(yàn)第7d采用Morris水迷宮進(jìn)行連續(xù)5d的定位航行實(shí)驗(yàn)和1d的空間探索實(shí)驗(yàn)，分別評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的學(xué)習(xí)能力和空間記憶能力。
　　3.大腦組織尼氏體染色:采用冷凍切片機(jī)以冠狀方向?qū)θX組織進(jìn)行連續(xù)切片。每組選取位置相同的前額葉皮質(zhì)(prefrontal cortex，PFC)和海馬(hippocampus，HPC)區(qū)域，采用

6、硫堇染液染色后，置于顯微鏡下觀察神經(jīng)元內(nèi)尼氏體的變化情況。
　　4.大腦組織免疫組化檢測(cè):采用大腦冷凍切片，每組選取位置相同的前額葉皮質(zhì)和HPC區(qū)域，分別采用抗神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞特異的標(biāo)記蛋白抗體進(jìn)行免疫組化染色，光鏡下觀察神經(jīng)元丟失和小膠質(zhì)細(xì)胞活化情況，并采用Image J軟件進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。
　　5.線粒體復(fù)合體Ⅰ～Ⅳ酶活性測(cè)定:斷頭處死動(dòng)物，制作組織勻漿，分別檢測(cè)大腦皮層線粒體復(fù)合體Ⅰ～Ⅳ酶活性變化。
　　6.炎性

7、因子和氧化抗氧化指標(biāo)的檢測(cè):采用ELISA法檢測(cè)大腦組織TNF-α含量，生化法分別大腦組織一氧化氮(nitric oxide，NO)、GSH、GSSG含量，并計(jì)算GSH/GSSG比值。
　　結(jié)果：
　　1.Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，1-BP模型組動(dòng)物給予800 mg/kg.bw1-BP染毒后，水迷宮實(shí)驗(yàn)中第2～5d的逃避潛伏期分別比對(duì)照組增加了60.8％，81.9％，124.0％和323.3％，游泳總距離增加了47.0

8、％，66.4％，106.0％和277.6％，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）?？臻g探索實(shí)驗(yàn)中，1-BP模型組動(dòng)物穿越平臺(tái)次數(shù)也較正常對(duì)照組明顯減少（P＜0.01）;給予1-BP同時(shí)給了不同劑量的EDA，其中1-BP+EDA5mg/kg。組大鼠第4d和第5d的逃避潛伏期分別比BP組減少了38.4％和44.3％（P＜0.01），游泳總距離減少了34.5％和43.3％(P＜0.05，P＜0.01)。
　　2.病理形態(tài)學(xué)觀

9、察到1-BP模型組大鼠大腦PFC小膠質(zhì)細(xì)胞激活明顯，神經(jīng)元丟失，細(xì)胞計(jì)數(shù)后與對(duì)照組比較差異顯著（P＜0.05，P＜0.01），給予EDA后動(dòng)物大腦前額葉皮質(zhì)小膠質(zhì)細(xì)胞活化和神經(jīng)元丟失明顯減輕。1-BP導(dǎo)致大鼠大腦前額葉皮質(zhì)神經(jīng)元明顯減少(P＜0.01)，3 mg/kg.bw和5 mg/kg.bw的EDA能夠明顯抑制1-BP導(dǎo)致的神經(jīng)元丟失(P＜0.05，P＜0.01)。尼氏染色結(jié)果與NeuN免疫組化染色結(jié)果趨勢(shì)一致。
　　3.1-

10、BP明顯降低大腦前額葉皮質(zhì)細(xì)胞線粒體復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ活性(P＜0.05，P＜0.01)。1-BP染毒同時(shí)給予不同劑量的EDA，大鼠大腦前額葉皮層線粒體復(fù)合體活性均有不同程度的升高。
　　4.1-BP染毒能夠升高大腦NO及TNF-α含量，1-BP模型組動(dòng)物大腦組織中NO、TNFα含量分別比正常對(duì)照組增加了147.6％(P＜0.05)和18.7％（P＜0.01）。1-BP+1 mg/kg.bwEDA、1-BP+3mg/kg.bw和

11、1-BP+5mg/kg.bwEDA組，NO分別比1-BP模型組降低了53.8％，55.4％和59.8％，TNF-α分別降低了12.2％、15.8％和22.2％，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。1-BP模型組動(dòng)物大腦皮層GSH含量也較對(duì)照組明顯降低(P＜0.01)，GSSG含量顯著升高(P＜0.01)，GSH/GSSG比值明顯降低（P＜0.01）;5mg/kg.bw劑量的EDA能夠明顯逆轉(zhuǎn)1-BP導(dǎo)致的GSH含量降低(P

12、＜0.01)，3mg/kg.bw和5mg/kg.bw的EDA能夠明顯升高GSH/GSSG比值（P＜0.01）。
　　結(jié)論：
　　1.1-BP能夠引起大鼠學(xué)習(xí)記憶下降，可能與1-BP導(dǎo)致與學(xué)習(xí)記憶功能的相關(guān)的PFC及HPC區(qū)域神經(jīng)元受損有關(guān)。
　　2.1-BP能夠激活大腦小膠質(zhì)細(xì)胞，并使NO含量升高、炎性因子TNF-α表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致炎性反應(yīng)。EDA減輕1-BP中樞神經(jīng)毒性的作用可能與其抑制1-BP暴露引起的神經(jīng)炎癥密切相