TSPO配體PK11195對神經(jīng)炎癥的保護作用及機制探討.pdf

1、轉(zhuǎn)位蛋白18 kDa(TSPO)主要是在甾體合成的組織中表達。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，主要由腦內(nèi)的膠質(zhì)細胞表達。TSPO蛋白主要負責合成多種甾體激素的限速步驟，即膽固醇由線粒體外膜向內(nèi)膜的轉(zhuǎn)運。此外，TSPO還在調(diào)節(jié)炎癥反應方面發(fā)揮著很重要的作用。在急性腦損傷和多種中樞神經(jīng)的退行性病變中均發(fā)現(xiàn)TSPO表達顯著增加。但TSPO蛋白表達的上調(diào)與神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生其因果關系目前尚不完全明確。此外，TSPO配體也在神經(jīng)保護、神經(jīng)增生、焦慮等方面表現(xiàn)

2、出了治療作用。大量體內(nèi)及體外研究顯示TSPO經(jīng)典配體PK11195、Ro5-4864能減少小膠質(zhì)細胞活化，對神經(jīng)炎癥具有抑制作用。但目前有關TSPO配體與認知功能和淀粉樣蛋白生成和累積關系的研究仍然較少。本實驗中，使用慢性脂多糖(LPS)腹腔注射制造小鼠神經(jīng)炎癥病理模型，該模型在許多研究中用來模擬AD的病理改變，包括中樞神經(jīng)炎癥、膠質(zhì)化、β-淀粉樣蛋白(Aβ)的累積及認知損害。本研究通過在體和離體實驗探討了TSPO的經(jīng)典配體PK1119

3、5的抗炎、抗淀粉樣蛋白生成、神經(jīng)保護作用及可能機制。
　　第一部分 TSPO配體PK11195對脂多糖誘導的神經(jīng)炎癥的保護作用及機制探討
　　目的:探討TSPO配體PK11195對脂多糖誘導的小鼠神經(jīng)炎癥的保護及可能的發(fā)生機制。
　　方法:C57BL/6J小鼠按體重隨機分為Control組、LPS組、LPS+PK11195組和PK11195組。 LPS+PK11195組及PK11195組腹腔注射PK11195(3 mg

4、/Kg)。PK11195注射三天后開始注射LPS，兩種藥物均注射至實驗結(jié)束。LPS劑量為預實驗確定的劑量，PK11195劑量根據(jù)文獻確定。LPS注射七天后，將小鼠先進行為期四天的水迷宮訓練，即隱蔽平臺訓練，結(jié)束后進行一天的水迷宮測試，即水迷宮探索實驗。實驗結(jié)束后，取腦并使用Western-blotting法對海馬COX-2、BACE-1、IDE以及BDNF蛋白表達量進行檢測。使用ELISA法進行海馬組織Aβ蛋白、孕酮、四氫孕酮含量測定。

5、
　　結(jié)果:1.預實驗結(jié)果提示引起C57BL/6J小鼠認知損害的最佳LPS劑量為500μg/Kg。2.水迷宮訓練實驗中，隱蔽平臺訓練結(jié)果顯示:在第一天訓練中，LPS組的小鼠需要更長的時間才能定位平臺;在訓練的第四天中，LPS組動物需要游動更長的距離才能定位平臺。在空間探索實驗里，LPS組的動物與對照組相比在水迷宮的原平臺所在的目標象限中停留時間縮短，目標象限游泳距離減少，PK11195預處理組預防了LPS導致的認知損害。3.與對照

6、組相比，LPS使海馬炎癥蛋白TSPO、COX-2的表達增加，PK11195預處理使該效應有所減弱。4.LPS顯著增加了海馬Aβx-42含量并伴隨BACE-1、IDE表達量的增加，PK11195預處理部分減輕了LPS導致的這種效應。5.LPS使小鼠海馬孕酮水平降低，PK11195預處理使LPS處理后的小鼠腦內(nèi)孕酮和四氫孕酮的含量均有所升高。6.LPS顯著降低了BDNF的在海馬內(nèi)的表達量，而PK11195預處理對注射LPS誘導的BDNF表達

7、量并無顯著影響。
　　結(jié)論:PK11195可以對慢性LPS注射導致的認知損害起保護作用?？赡艿臋C制包括減輕神經(jīng)炎癥及小膠質(zhì)細胞的激活，增加神經(jīng)甾體激素的合成，減少Aβ蛋白的累積，并伴有BACE-1的表達下調(diào)。
　　第二部分 PK11195對Aβ1-42形成的寡聚體導致BV-2細胞炎癥模型的保護作用及機制
　　目的:Aβ1-42寡聚體誘導BV-2激活作為炎癥細胞模型，探討TSPO經(jīng)典配體PK11195的對該模型的作用及機

8、制。
　　方法:首先使用Aβ1-42形成的寡聚體誘導BV-2細胞損傷模型，使用CCK-8試劑盒根據(jù)BV-2細胞存活率確定PK11195對Aβ1-42激活BV-2細胞模型保護作用的最佳濃度。并使用Western-blotting的方法確定Aβ1-42寡聚體、PK11195對BV-2細胞表達TSPO、COX-2及BACE-1蛋白的影響。
　　結(jié)果:1.使用CCK-8試劑盒根據(jù)BV-2細胞存活率確定Aβ1-4210μM作為建立BV

9、-2細胞損傷模型的劑量，作用時間選擇48 h。2.PK11195在0.01μM、0.1μM的濃度時對Aβ1-42損傷的BV-2細胞具有顯著地保護作用，其量效關系為倒U形曲線。3.Western-blotting結(jié)果顯示Aβ1-42(10μM)使BV-2細胞TSPO、COX-2蛋白表達量顯著升高，PK11195(0.1μM)則逆轉(zhuǎn)了Aβ1-42的該作用。4.Western-blotting結(jié)果顯示Aβ1-42(10μM)使BV-2細胞BA

10、CE-1蛋白表達量顯著升高，PK11195(0.1μM)則逆轉(zhuǎn)了Aβ1-42的該作用。
　　結(jié)論:我們的研究顯示小膠質(zhì)細胞的激活與Aβ蛋白導致的中樞神經(jīng)炎癥關系非常密切。Aβ蛋白激活BV-2細胞，使COX-2、TSPO表達增加，同時使BACE-1表達也增加、Aβ蛋白生成進一步增加，并形成惡性循環(huán)，并最終對BV-2細胞也造成損害。而TSPO配體PK11195可使BV-2細胞激活程度下降，產(chǎn)生的炎癥蛋白減少、BACE-1蛋白表達下降并