電針通過(guò)神經(jīng)元α7nAChR調(diào)控炎癥小體減輕腦缺血后神經(jīng)炎癥的作用及其機(jī)制.pdf

1、缺血性腦卒中是導(dǎo)致患者神經(jīng)功能障礙及肢體癱瘓的重要原因之一。盡管重組組織型纖溶酶原激活物(r-tPA)是一種有效的治療方式,由于治療時(shí)間窗較窄，只有3-5％病人能夠接受并可能從中受益。電針腦保護(hù)策略是我科提出的預(yù)防圍術(shù)期腦缺血損傷的新策略，電針可以減輕動(dòng)物MCAO后神經(jīng)功能缺失及減少梗死面積。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，電針可增加缺血再灌注后腦內(nèi)內(nèi)源性大麻素AEA和2-AG含量，同時(shí)上調(diào)CB1R，調(diào)控RISK通路中（ERK、εPKC、GSK-3β

2、、STAT3等功能分子的磷酸化水平）、抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮腦保護(hù)作用。此外，我們發(fā)現(xiàn)電針可以通過(guò)調(diào)節(jié)神經(jīng)元膽堿能抗炎通路中α7nAChR抑制HMGB1釋放減輕腦缺血后神經(jīng)炎癥。
　　NLRP3炎癥小體作為觸發(fā)炎癥反應(yīng)的整合平臺(tái)，主要由NLRP3、ASC和caspase1前體組成。當(dāng)各種危險(xiǎn)信號(hào)作用于細(xì)胞膜上TLRs受體后，激活了細(xì)胞內(nèi)NF-κB通路，促進(jìn)炎癥小體蛋白和IL-1β、IL-18前體的合成；細(xì)胞內(nèi)各種DAMPs刺激

3、活化NLRP3炎癥小體，切割活化procaspase1并促進(jìn)IL-1β、IL-18成熟和釋放，發(fā)揮促炎作用。此外，caspase1通過(guò)一種特殊的方式激活了細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的死亡。綜上所述，NLRP3炎癥小體在啟動(dòng)固有免疫反應(yīng)，caspase1活化以及腦缺血后神經(jīng)系統(tǒng)無(wú)菌性炎癥反應(yīng)中均發(fā)揮重要作用。
　　因此，本實(shí)驗(yàn)旨在探索電針是否通過(guò)神經(jīng)元α7nAChR調(diào)控炎癥小體減輕腦缺血后神經(jīng)炎癥的作用及其機(jī)制，為電針腦保護(hù)作用

4、提供了更多實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為電針向臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化提供了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。
　　實(shí)驗(yàn)一腦缺血再灌注損傷對(duì)炎癥小體表達(dá)的影響
　　目的:
　　觀察腦缺血再灌注損傷后不同時(shí)間點(diǎn)炎癥小體表達(dá)的變化。
　　方法:
　　雄性SD大鼠20只，隨機(jī)分為假手術(shù)Sham組(n=4)、MCAO組(n=16)。其中MCAO組再隨機(jī)分為四組(n=4)，行大腦中動(dòng)脈阻塞模型1.5小時(shí)后，分別于再灌注后的6h、24h、3d、7d處死，取同側(cè)半暗

5、帶皮層組織，Western Blot檢測(cè)炎癥小體蛋白NLRP3、Cl.Caspase1和Mature IL-1β的變化。
　　結(jié)果:
　　與Sham組相比，NLRP3在MCAO后24h、3d、7d表達(dá)明顯增高(P<0.01)，Cl.Caspase1在MCAO后3d、7d表達(dá)增高(P<0.01)，Mature IL-1β含量在MCAO后6h、24h、3d、7d表達(dá)均明顯增高(P<0.01)。
　　結(jié)論:
　　腦缺血

6、再灌注損傷后不同時(shí)間點(diǎn)炎癥小體表達(dá)逐漸升高，其中腦缺血再灌注后3d炎癥小體表達(dá)量最高，因此我們選擇3d這個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行電針干預(yù)。
　　實(shí)驗(yàn)二電針對(duì)腦缺血再灌注后NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的影響
　　目的:
　　1.證實(shí)電針抑制了腦缺血再灌注后NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。
　　2.探索電針是否調(diào)節(jié)了腦缺血再灌注后缺血半暗帶區(qū)促炎因子和抗炎因子表達(dá)平衡。
　　方法:
　　1.電針是否抑制腦缺血再

7、灌注后NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)
　　雄性 SD大鼠21只，隨機(jī)分為假手術(shù) Sham組(n=7)、MCAO3d組(n=7)及電針EA+MCAO3d組(n=7)。其中MCAO3d組及EA+MCAO3d組，行大腦中動(dòng)脈阻塞模型1.5小時(shí)后，分別于再灌注后3d取材。Western Blot檢測(cè)炎癥小體蛋白 NLRP3、Cl.Caspase1和Mature IL-1β的變化；免疫熒光染色檢測(cè)NLRP3和Caspase1表達(dá)變化情況。

8、
　　2.電針是否調(diào)節(jié)腦缺血再灌注后缺血半暗帶區(qū)促炎因子和抗炎因子表達(dá)的平衡
　　雄性 SD大鼠24只，隨機(jī)分為假手術(shù) Sham組(n=8)、MCAO3d組(n=8)及電針EA+MCAO3d組(n=8)。ELISA試劑盒檢測(cè)促炎因子IL-18、TNF-α和抑炎因子TGF-β1、IL-10表達(dá)含量的變化。
　　結(jié)果:
　　1.與MCAO3d組相比，電針降低了腦缺血再灌注后NLRP3、Cl.Caspase1和Matu

9、re IL-1β表達(dá)含量(P<0.01)；作為Westernblot的佐證，免疫熒光染色同樣證實(shí)了電針降低了腦缺血再灌注后神經(jīng)元中NLRP3和Caspase1免疫熒光強(qiáng)度。
　　2.相比于MCAO3d組，電針降低了腦缺血再灌注后促炎因子IL-18和TNF-α表達(dá)含量(P<0.05)，同時(shí)升高了抗炎因子TGF-β1和IL-10表達(dá)含量(P<0.01)。
　　結(jié)論:
　　電針不僅抑制了腦缺血后NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的炎癥反

10、應(yīng)，同時(shí)，調(diào)節(jié)了腦缺血后缺血半暗帶區(qū)促炎因子和抗炎因子表達(dá)的平衡。
　　實(shí)驗(yàn)三α7nAChR參與電針對(duì)NLRP3炎癥小體的抑制并發(fā)揮腦保護(hù)作用
　　目的:
　　證實(shí)α7nAChR參與電針對(duì)NLRP3炎癥小體的抑制并發(fā)揮腦保護(hù)作用。
　　方法:
　　雄性SD大鼠112只，隨機(jī)分為假手術(shù)Sham組、MCAO組、電針EA+MCAO組、α7nAChR的抑制劑α-BGT組、α-BGT溶劑組、α7nAChR的激動(dòng)劑PH

11、A-543,613組、PHA-543,613溶劑組(n=16)。腦缺血再灌注后3d，取半暗帶組織Western Blot檢測(cè)神經(jīng)元中α7nAChR表達(dá)含量和炎癥小體蛋白NLRP3，Cl.Caspase1和Mature IL-1β的表達(dá)變化(n=4)，3d后評(píng)估神經(jīng)行為學(xué)及腦梗死體積的大小(n=8)，以及使用TUNEL染色觀察凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目(n=4)。
　　結(jié)果:
　　1.與MCAO3d組相比，電針上調(diào)了腦缺血再灌注后α7n

12、AChR表達(dá)含量(P<0.01)。
　　2.與EA+MCAO組相比，EA+α-BGT組上調(diào)了炎癥小體蛋白NLRP3、Cl.Caspase1和Mature IL-1β的表達(dá)(P<0.01)；同時(shí)，EA+α-BGT組腦梗死體積百分比增加(Ρ<0.05)，神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分降低(P<0.01)，而且TUNEL染色凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目明顯增加(Ρ<0.05)。
　　3.與MCAO組相比，PHA-543,613不僅可降低腦梗死體積百分比(P<

13、0.01)，改善神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分(P<0.01)，而且減少TUNEL染色凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目(Ρ<0.01)；同時(shí)，PHA-543,613組下調(diào)了炎癥小體蛋白NLRP3、Cl.Caspase1和Mature IL-1β的表達(dá)(P<0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.電針增加了腦缺血再灌注后α7nAChR表達(dá)含量。
　　2.給予α7nAChR抑制劑α-BGT干預(yù)，可逆轉(zhuǎn)電針對(duì)NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的抑制；同時(shí)α-BGT

14、逆轉(zhuǎn)了電針的腦保護(hù)作用。
　　3.應(yīng)用α7nAChR的激動(dòng)劑PHA-543,613干預(yù)，可誘導(dǎo)與電針相似的保護(hù)作用；同時(shí)，PHA-543,613抑制NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。
　　綜上所述，α7nAChR參與電針對(duì)NLRP3炎癥小體的抑制并發(fā)揮腦保護(hù)作用。
　　小結(jié):
　　本實(shí)驗(yàn)采用雄性SD大鼠MCAO模型，首先通過(guò)western-blot證實(shí)了腦缺血后不同時(shí)間點(diǎn)炎癥小體表達(dá)逐漸升高，其中腦缺血后3d炎癥

15、小體表達(dá)量最高。隨后，選擇3d這個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行電針干預(yù)，發(fā)現(xiàn)電針抑制了腦缺血后 NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，同時(shí)調(diào)節(jié)了腦缺血后缺血半暗帶區(qū)促炎因子和抗炎因子表達(dá)平衡。那么，電針抑制NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的機(jī)制是什么呢？針對(duì)這一問(wèn)題，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)選擇了α7nAChR抑制劑α-BGT和激動(dòng)劑PHA-543,613進(jìn)行干預(yù)，證實(shí)了α7nAChR參與電針對(duì)NLRP3炎癥小體的抑制并發(fā)揮腦保護(hù)作用。總之，本研究發(fā)現(xiàn)電針通過(guò)神經(jīng)元α7n