海馬神經(jīng)元半通道在腦缺血過程中開放及其調(diào)控機制的研究.pdf

1、腦血管疾病(cerebrovascular disease，CVD)是指由于各種腦血管病變所引起的腦部病變，是目前人類死亡和殘疾的主要原因之一，該疾病的發(fā)生主要與腦血流減少和缺血性腦損傷有關(guān)。許多繼發(fā)性因素在缺血后的腦損傷中發(fā)揮重要作用?？p隙連接(gap junction)是在兩個細胞互相靠近的細胞膜處，各自由6個連接蛋白亞單位形成的半通道(hemichannel)相互連接而形成的。至少21種connexin基因和3種pannexin基

2、因序列編碼人的連接蛋白。據(jù)報道，腦缺血可使海馬神經(jīng)元pannexinl半通道開放并導(dǎo)致細胞內(nèi)離子穩(wěn)態(tài)失衡，葡萄糖和ATP等細胞內(nèi)重要物質(zhì)泄漏等一系列可引起細胞死亡的事件發(fā)生。盡管已知半通道的開放可導(dǎo)致上述嚴重后果，但是對半通道開放的調(diào)控機制還不甚明了，尤其對pannexinl半通道的調(diào)控方式及相關(guān)信號通路研究少見報道。 為了闡明參與調(diào)控海馬神經(jīng)元半通道的細胞和分子機制，本研究以離體培養(yǎng)海馬神經(jīng)元缺氧缺糖模型(OGD)、代謝抑制模

3、型(MI)和動物在體局部腦缺血模型(MCAO)為實驗對象，從細胞和分子兩個層面研究缺血性腦損傷時半通道開放及其調(diào)控機制，并對與之相關(guān)的信號通路進行了探討。 本研究在建立離體培養(yǎng)海馬神經(jīng)元OGD、MI模型的基礎(chǔ)上，采用由生物惰性熒光染料calcein green示蹤和一氧化氮(NO)特異性探針標記，激光共聚焦顯微鏡實時檢測的方法對半通道開放狀態(tài)及這兩種模型條件下細胞內(nèi)NO進行了檢測。結(jié)果顯示OGD和MI兩種腦缺血細胞模型均可導(dǎo)致大

4、鼠海馬神經(jīng)元pannexinl半通道通透性和NO生成量的增加。過量生成的NO和pannexinl半通道通透性增加之間是否存在聯(lián)系?為了進一步探討NO是否參與pannexinl半通道的調(diào)控，本研究還分別對NO供體和一氧化氮合酶(NOS)抑制劑處理后的pannexinl半通道通透性進行了檢測。發(fā)現(xiàn)NO供體可以導(dǎo)致pannexinl半通道通透性增加，而使用NOS抑制劑抑制NO的產(chǎn)生可降低pannexinl半通道的通透性。以上結(jié)果表明，腦缺血時

5、過量生成的NO可能參與了半通道開放狀態(tài)的調(diào)控。目前已有大量文獻報道NO可以參與調(diào)控細胞膜上多種離子通道，但NO是否參與、如何參與半通道調(diào)控的研究少見報道。 在上述研究基礎(chǔ)上，針對NO相關(guān)信號通路的研究發(fā)現(xiàn)在NO對pannexinl半通道的調(diào)控過程中非NO-cGMP依賴的亞硝基化反應(yīng)起了主要作用，而傳統(tǒng)的NO-cGMP信號通路對pannexinl的調(diào)控并不起主要作用。這與目前對NO作用途徑的認識相一致，即在生理條件下NO的作用主要

6、由NO-cGMP信號通路介導(dǎo)，而在病理損傷條件下過量生成的NO主要通過亞硝基化損傷及氧化損傷的方式而起作用。 半通道通透性增加既可由其開放概率增加引起也可由膜上半通道數(shù)量增加所致。所以，本研究通過應(yīng)用免疫熒光標記技術(shù)、激光共聚焦顯微鏡成像技術(shù)、膜蛋白分離技術(shù)和蛋白印記技術(shù)對OGD處理1小時后pannexinl蛋白的分布進行了研究。結(jié)果顯示在OGD處理海馬神經(jīng)元1小時后pannexinl蛋白在細胞內(nèi)的分布沒有改變，細胞膜上pann

7、exinl蛋白量也沒有增加。這提示在前述實驗中pannexinl半通道通透性的增加主要是因半通道開放概率增加所致。 最后，通過對OGD、OGD/再灌注、MI、局部腦缺血及局部腦缺血/再灌注模型中海馬神經(jīng)元pannexinl mRNA表達量進行檢測發(fā)現(xiàn)panexinl mRNA表達在OGD、OGD／再灌注及局部腦缺血／再灌注模型中均有上調(diào)，這提示panexinl可能在急性腦缺血及缺血／再灌注的病理損傷過程中起作用。 綜上所

8、述，本研究的主要結(jié)論及創(chuàng)新點如下：①、在急性腦缺血時海馬錐體神經(jīng)元細胞膜通透性增加主要是因為細胞膜上半通道開放概率增加所致;②、腦缺血時過量生成的NO參與調(diào)控pannexinl半通道的開放，具體調(diào)節(jié)是通過非NO-cGMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的方式進行，亞硝基化反應(yīng)或其它氧化反應(yīng)在調(diào)節(jié)中起了主要作用;③、海馬錐體神經(jīng)元pannexinl半通道在腦缺血模型中開放概率增加，OGD、oGD／再灌注和MCAO／再灌注模型均可導(dǎo)致pannexinl mRN