迷走神經(jīng)電刺激對大鼠MCAO-再灌注損傷的保護作用及機制探討.pdf

1、背景與目的：近年靜脈溶栓的普及和血管內治療的開展，給缺血性卒中患者帶來希望。但血管再通后繼發(fā)的再灌注損傷可導致腦損傷和功能損害進一步加重。目前認為，干預腦缺血再灌注損傷（ischemia-reperfusion, I/R）對于缺血性腦卒中的防治具有重要的意義。迷走神經(jīng)電刺激（vagus nerve stimulation,VNS）早在1997年通過美國食品和藥品監(jiān)督局批準，應用于臨床治療難治性癲癇患者。近年國內外研究顯示，VNS對大鼠腦

2、 I/R損傷具有神經(jīng)保護作用。國外一項臨床試驗已經(jīng)表明，VNS聯(lián)合康復訓練治療上肢無力的缺血性腦卒中患者是可行的。然而，關于VNS對缺血性腦卒中的具體保護機制，國內外仍缺乏系統(tǒng)而深入的研究。脂質運載蛋白型前列腺素D合成酶（Lipocalin-type prostaglandin D synthase, L-PGDS）是一種雙功能蛋白質，具有催化前列腺素D2合成和轉運親脂性物質的作用。L-PGDS在中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nerou

3、s system, CNS）中表達量豐富，并有益于保護腦缺血損傷。但L-PGDS在CNS特別是缺血性腦卒中中的作用機制不明。本研究擬通過VNS干預對大鼠腦I/R損傷后凋亡、炎癥反應及血腦屏障的影響及可能的作用機制進行探討，并觀察 L-PGDS表達變化在其中的作用，為缺血性腦卒中的治療提供新思路。
　　方法：
　　第一部分：采用大鼠大腦中動脈閉塞/再灌注（middle cerebral artery occlusion/rep

4、erfusion, MCAO/R）模型，ELISA和Western blot技術檢測L-PGDS在再灌注后12h，24h，3d及7d的表達變化。免疫熒光雙標檢測L-PGDS在缺血半暗帶區(qū)的表達定位。構建慢病毒shRNA-L-PGDS沉默L-PGDS表達，采用激光共聚焦檢測綠色熒光蛋白（Green Fluorescent Protein,GFP）的表達以明確慢病毒是否轉染成功；采用熒光定量PCR檢測慢病毒載體對大鼠腦內L-PGDS mRN

5、A的干擾效率。慢病毒轉染7天后制備大鼠MCAO/R模型，MCAO后30min給予VNS干預。實驗操作過程中監(jiān)測大鼠的生理參數(shù)（心率、血壓及血氣）以及右側大腦中動脈（middle cerebral artery，MCA）供血區(qū)腦組織血流量變化。再灌注24h時，利用Western blot和熒光定量PCR檢測各組大鼠缺血半暗帶區(qū)L-PGDS的表達。再灌注24h后對各組大鼠進行神經(jīng)功能缺失評分并測定腦梗死體積。采用TUNEL染色檢測大鼠缺血側

6、皮層神經(jīng)元凋亡的數(shù)量。Western Blot檢測凋亡通路分子（Bcl-2、Bax及cleaved caspase-3）的表達變化。免疫共沉淀檢測L-PGDS和PPARγ的相互作用。采用熒光定量PCR和Western blot檢測各組大鼠缺血半暗帶區(qū)PPARγ的表達。
　　第二部分：構建慢病毒shRNA-L-PGDS沉默L-PGDS表達，慢病毒轉染后7天制備大鼠MCAO/R模型，MCAO后30min給予VNS干預。再灌注24h時，

7、檢測各組大鼠腦組織中伊文思藍滲出量和腦組織水含量。采用Western blot檢測緊密連接蛋白occludin，MMP-9及AQP4的表達。采用ELISA檢測缺血半暗帶區(qū)腫瘤壞死因子α（Tumor necrosis factorα，TNF-α）和白介素-6（Interleukin6，IL-6）的表達水平。
　　結果：
　　第一部分：
　　(1)腦I/R損傷誘導了大鼠缺血側皮質L-PGDS的表達增加（P＜0.05），這種

8、增加的趨勢一直持續(xù)到再灌注后3d，在再灌注24h時達到峰值。在缺血半暗帶區(qū)皮質中，L-PGDS與NeuN和APC存在共表達，與GFAP無共表達。
　　(2)構建的慢病毒載體可有效轉染到大鼠腦組織中。與正常組和空病毒組相比，慢病毒shRNA-L-PGDS明顯抑制了L-PGDS mRNA的表達（P＜0.05）。
　　(3)在整個實驗操作過程中，VNS干預對大鼠的生理參數(shù)（包括平均心率、血壓和血氣指標）以及右側MCA供血區(qū)腦血流量

9、改變無明顯影響（P＞0.05）。
　　(4)再灌注24h時，與缺血再灌注組（I/R）相比，VNS干預可進一步增強腦I/R誘導的L-PGDS蛋白和mRNA表達水平增加（P＜0.05）；慢病毒載體介導的L-PGDS shRNA可有效抑制腦 I/R損傷誘導的L-PGDS蛋白和mRNA表達水平增加（P＜0.05），并減弱了VNS的增強效應（P＜0.05）。
　　(5)再灌注24h時，VNS可改善腦I/R損傷導致的神經(jīng)功能障礙并減少腦

10、梗死體積（P＜0.05）；沉默L-PGDS后，進一步加重腦I/R損傷導致的腦組織損傷并削弱了VNS神經(jīng)保護作用（P＜0.05），提示L-PGDS可能參與了 VNS對缺血性卒中的神經(jīng)保護作用。
　　(6)與I/R組相比，VNS可明顯減少大鼠缺血半暗帶區(qū)神經(jīng)元凋亡數(shù)量（P＜0.05）；沉默L-PGDS后，加重了腦I/R損傷誘導的神經(jīng)元凋亡，并抑制了VNS的抗凋亡效應（P＜0.05）。
　　(7)與假手術組相比，I/R組大鼠缺血側

11、皮層中凋亡蛋白Bax和cleaved caspase-3的表達明顯增加（P＜0.05），抗凋亡蛋白Bcl-2的表達明顯降低（P＜0.05）。與I/R組相比，VNS干預后Bax和cleaved caspase-3的表達明顯減少（P＜0.05），Bcl-2的蛋白表達明顯增加（P＜0.05）；沉默L-PGDS表達后大鼠缺血側皮層Bax和 cleaved caspase-3的表達進一步增加（P＜0.05），蛋白Bcl-2的表達進一步降低（P＜0

12、.05），并明顯削弱VNS的抗凋亡作用（P＜0.05），提示L-PGDS可能介導了VNS對缺血性卒中的抗凋亡效應。
　　(8)免疫共沉淀檢測證實L-PGDS與PPARγ之間存在相互作用。
　　(9)與假手術組相比，腦I/R損傷誘導了缺血半暗帶區(qū)PPARγ蛋白和mRNA表達增加（P＜0.05）。與I/R組相比，VNS干預可進一步增強PPARγ蛋白和mRNA表達；沉默L-PGDS表達后缺血半暗帶區(qū)PPARγ蛋白和mRNA表達水平

13、明顯下降（P＜0.05），并減弱了VNS的增強效應（P＜0.05）。
　　第二部分：
　　(1)再灌注24h時，與假手術組相比，腦I/R損傷誘導了缺血側腦組織伊文思藍滲出量顯著增多，腦組織水含量明顯增加（P＜0.05）。與I/R組相比，VNS減少了伊文思藍的滲出量和腦組織的水含量（P＜0.05）；沉默L-PGDS后，加重了腦I/R損傷誘導的伊文思藍滲出和腦組織水含量增加（P＜0.05），并削弱了VNS對I/R損傷血腦屏障破壞

14、的改善作用（P＜0.05），提示L-PGDS可能參與了VNS對血腦屏障的保護作用。
　　(2)與假手術組相比，I/R組大鼠缺血半暗帶區(qū)AQP4和 MMP-9的表達明顯增加（P＜0.05），occludin的表達明顯降低（P＜0.05）。與I/R組相比，VNS干預可減少AQP4和MMP-9的表達（P＜0.05），增加occludin的表達（P＜0.05）；沉默L-PGDS后，進一步增加了腦I/R損傷誘導的AQP4和MMP-9的表達（

15、P＜0.05），進一步降低了occludin的表達（P＜0.05），并減弱了VNS對血腦屏障的改善作用（P＜0.05），提示L-PGDS可能介導了VNS對腦I/R后血腦屏障的保護作用。
　　(3)VNS可減輕急性腦I/R損傷誘導的炎癥反應，抑制缺血側皮質中炎性細胞因子TNF-α和IL-6的表達（P＜0.05）；沉默L-PGDS后，VNS的抗炎效果明顯下降，炎癥因子的表達增加（P＜0.05），提示L-PGDS參與了VNS對缺血性腦卒

16、中后炎癥反應的抑制。
　　結論：
　　(1) VNS可減少急性腦缺血再灌注大鼠的腦梗死體積，改善大鼠的神經(jīng)功能缺失。
　　(2) VNS干預減少急性腦缺血再灌注大鼠缺血半暗帶區(qū)神經(jīng)元凋亡的數(shù)量，抑制凋亡蛋白Bax和cleaved caspase-3的表達，增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，減輕了腦缺血再灌注損傷誘導的凋亡反應。
　　(3) VNS干預減少急性腦缺血再灌注后緊密連接蛋白occludin的降解，降低MM