外周型苯二氮卓受體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(TSPO)在小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的作用及機(jī)制的探討.pdf

1、目的：⑴研究TSPO表達(dá)與小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)關(guān)系。⑵研究TSPO配體對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的激活抑制作用。⑶研究TSPO基因在小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的作用。⑷研究TSPO配體抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化的作用機(jī)制。
　　 方法：①在BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)體系上，加入LPS(100 ng/ml)分別于30 min，1 h，2h，4 h，6 h，12 h，24 h后用倒置相差顯微鏡觀察BV-2細(xì)胞的生長(zhǎng)分布狀況及形態(tài)學(xué)改變，用ELISA測(cè)定BV-2細(xì)胞釋

2、放TNF-α、IL-1β和IL-6三種細(xì)胞因子水平。②在BV-2細(xì)胞培養(yǎng)體系上，加入LPS(100 ng/ml)分別于分別于4 h，8 h，24 h，48 h后用Real-time PCR檢測(cè)TSPO在LPS誘導(dǎo)BV-2細(xì)胞中的表達(dá)。③BV-2細(xì)胞培養(yǎng)體系上，加入LPS(100 ng/ml)造成BV-2細(xì)胞活化狀態(tài)的細(xì)胞模型，然后給予不同劑量(10μM、50μM、100μM)TSPO配體(PK11195和Ro5-4864)，用ELISA

3、和Real-time PCR觀察不同劑量TSPO配體(PK11195和Ro5-4864)對(duì)LPS誘導(dǎo)BV-2細(xì)胞分泌炎癥因子的影響。④用TSPO siRNA轉(zhuǎn)染BV-2細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后，用在Real-time PCR和Western blot檢測(cè)TSPO基因沉默效果；在轉(zhuǎn)染TSPO siRNA BV-2細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)體系上，加入LPS(100 ng/ml)于4 h后用ELISA和Real-time PCR檢測(cè)沉默TSPO基因?qū)PS誘

4、導(dǎo)BV-2細(xì)胞分泌炎癥因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)的影響。⑤在轉(zhuǎn)染TSPO siRNA BV-2細(xì)胞培養(yǎng)體系上，加入LPS(100 ng/ml)造成轉(zhuǎn)染TSPO siRNA BV-2細(xì)胞活化狀態(tài)的細(xì)胞模型，然后給予不同劑量(10μM、50μM、100μM)TSPO配體(PK11195和Ro5-4864)，用ELISA和Real-timePCR觀察不同劑量TSPO配體(PK11195和Ro5-4864)對(duì)LPS誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染TSPO

5、siRNA BV-2細(xì)胞分泌炎癥因子的影響。⑥通過(guò)Western blot技術(shù)檢測(cè)給予不同劑量(10μM、50μM、100μM)TSPO配體(PK11195和Ro5-4864)處理經(jīng)LPS誘導(dǎo)的BV-2細(xì)胞內(nèi)的Erk、JNK及p38的磷酸化程度及IκB的降解程度，從而了解TSPO配體(PK11195和Ro5-4864)對(duì)BV-2細(xì)胞內(nèi)MAPK及NF-κB的激活情況。⑦用流式細(xì)胞儀檢測(cè)在100μM TSPO配體(PK11195和Ro5-4

6、864)作用24 h時(shí)單個(gè)VB-2細(xì)胞的熒光強(qiáng)度(MFI)，分析TSPO配體(PK11195和Ro5-4864)單個(gè)VB-2細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度([Ca2+]i)的影響情況。
　　 結(jié)果：⑴LPS可誘導(dǎo)BV-2細(xì)胞活化，表現(xiàn)為：BV-2細(xì)胞形態(tài)隨著LPS作用時(shí)問(wèn)延長(zhǎng)逐漸變成呈現(xiàn)典型的阿米巴樣“活化狀態(tài)小膠質(zhì)細(xì)胞”外觀；活化的BV-2細(xì)胞合成、釋放TNF-α、IL-1β和IL-6等炎癥因子，并與LPS作用時(shí)間和劑量呈正相關(guān)。⑵TSPO

7、在靜息的BV-2細(xì)胞中有一定量表達(dá)，表達(dá)量不多，在LPS誘導(dǎo)BV-2細(xì)胞活化中表達(dá)增多，并隨LPS干預(yù)時(shí)間延長(zhǎng)而呈增多趨勢(shì)，在LPS作用24 h時(shí)才有明顯增多，48 h增多更顯著(P＜0.01)。⑶TSPO配體PK11195和Ro5-4864有抗炎作用，它們能顯著在抑制LPS誘導(dǎo)BV-2細(xì)胞分泌IL-1β和IL-6，并與劑量呈正相關(guān)，濃度越高，抑制效果越強(qiáng)。但對(duì)TNF-α沒(méi)有抑制作用。對(duì)IL-1β，Ro5-4864抑制效果與PK1119

8、5相當(dāng)，但對(duì)IL-6，Ro5-4864抑制效能比PK11195強(qiáng)，顯示Ro5-4864比PK11195具有更強(qiáng)抗炎作用。⑷BV-2細(xì)胞轉(zhuǎn)染TSPO siRNA后TSPO mRNA表達(dá)和蛋白含量均比對(duì)照組低，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，表明TSPO siRNA能有效沉默TSPO基因表達(dá)。沉默TSPO基因后LPS活化BV-2細(xì)胞分泌的TNF-α、IL-1β和IL-6并沒(méi)有減少，表明沉默TSPO基因?qū)PS活化BV-2細(xì)胞分泌的TN

9、F-α、IL-1β和IL-6無(wú)抑制作用，提示TSPO基因不直接介導(dǎo)BV-2細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，或者在BV-2細(xì)胞的炎癥反應(yīng)不是處于主導(dǎo)作用。⑸轉(zhuǎn)染TSPO siRNA BV-2細(xì)胞在LPS+PK11195和LPS+Ro5-4864處理后IL-1β和IL-6的分泌量呈現(xiàn)明顯下降；轉(zhuǎn)染control siRNA BV-2細(xì)胞在同樣LPS+PK11195和LPS+Ro5-4864處理后IL-1β和IL-6的分泌量也呈現(xiàn)明顯下降，但它們之間差異無(wú)統(tǒng)

10、計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。表明TSPO配體PK11195和Ro5-4864抑制LPS誘導(dǎo)BV-2細(xì)胞分泌IL-1β、IL-6不受TSPO基因的影響，提示TSPO基因不直接調(diào)節(jié)TSPO配體的抗炎作用，或者在TSPO配體的抗炎作用處于次要作用。⑹PK11195和Ro5-4864不影響LPS誘導(dǎo)BV-2細(xì)胞內(nèi)Erk，JNK，p38蛋白磷酸化和IκB蛋白的降解，但能影響B(tài)V-2細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，PK11195能顯著地引起B(yǎng)V-2細(xì)胞內(nèi)Ca2+

11、濃度增加，細(xì)胞內(nèi)Ca2+熒光值(MFI)由1.95±0.16升高到3.37±0.14，兩者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；Ro54864卻作用相反，能顯著地降低BV-2細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，細(xì)胞內(nèi)Ca2+熒光值(MFI)由1.95±0.16降低到1.56±0.09，兩者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。⑺TSPO配體PK11195和Ro54864能加快LPS誘導(dǎo)BV-2細(xì)胞IL-1β和IL-6mRNA降解速度，在PK11195作

12、用1h、2 h后，LPS誘導(dǎo)BV-2細(xì)胞內(nèi)IL-1β和IL-6 mRNA分別減少60.2％、64.3％和69.4％、74.1％；在Ro5-4864作用下，IL-1β和IL-6 mRNA分別減少58.2％、60.2％和66.9％、70.0％。IL-1β和IL-6 mRNA半衰期明顯縮短，均由原來(lái)2 h縮短到1 h左右。表明PK1195和Ro5-4864能降低IL-1β和IL-6 mRNA穩(wěn)定性。
　　 結(jié)論：①LPS可誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)

13、胞的應(yīng)激活化，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)阿米巴樣“活化狀態(tài)小膠質(zhì)細(xì)胞”外觀，并合成、釋放TNF-α、IL-1β和IL-6等炎癥因子。LPS是通過(guò)MAPKs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和NF-κB轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)導(dǎo)來(lái)誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞分泌炎癥因子。②TSPO在小膠質(zhì)細(xì)胞中確有表達(dá)，在靜息的小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)較低，在LPS誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞活化中(在LPS作用24 h以后)呈現(xiàn)高表達(dá)，結(jié)合第一部分研究結(jié)果表明了TSPO表達(dá)與BV-2細(xì)胞的激活狀態(tài)呈正相關(guān)。TSPO表達(dá)升高是

14、小膠質(zhì)細(xì)胞活化狀態(tài)的后期反應(yīng)事件，可反映小膠質(zhì)細(xì)胞活化狀態(tài)，可能參與調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞活化的功能。③TSPO配體PK11195和Ro5-4864有抗炎作用，它們能抑制LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞活性，減少LPS活化小膠質(zhì)細(xì)胞分泌IL-1β和IL-6等炎癥因子。TSPO配體PK11195和Ro5-4864抑制LPS活化小膠質(zhì)細(xì)胞分泌IL-1β、IL-6不通過(guò)TSPO基因(即不受TSPO基因的影響)，說(shuō)明了TSPO基因不直接介入TSPO配體的抗炎作用

15、，或者在TSPO配體的抗炎作用處于次要作用，起著傳遞信息作用，把信息傳遞給PBR另兩個(gè)亞單位(VDAC和ANT)，進(jìn)一步說(shuō)明了PBR三個(gè)亞單位(TSPO，VDAC和ANT)是相互聯(lián)系、相互作用形成一個(gè)復(fù)合體。異喹啉(PK11195)可單獨(dú)結(jié)合到異喹啉結(jié)合點(diǎn)(TSPO)上，但與TSPO特異結(jié)合的苯二氮卓類藥物(Ro5-4864)則需要這3個(gè)亞單位之間的相互作用。因此，Ro5-4864抑制LPS誘導(dǎo)BV-2細(xì)胞分泌IL-6的效能比PK111

16、95強(qiáng)，而在抑制IL-1β上兩者效果相當(dāng)，顯示Ro5-4864比PK11195具有更強(qiáng)抗炎作用。這些研究結(jié)果表明了反映了把原先稱為PBR的DBI亞單位改稱TSPO18 kDa[translocator protein18 kDa(轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白18 kDa)]更能確切反應(yīng)TSPO生理、藥物功能，有利于進(jìn)一步闡明PBR的結(jié)構(gòu)和功能。④TSPO配體PK11195和Ro5-4864不是通過(guò)MAPKs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和NF-κB轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)導(dǎo)來(lái)抑制LPS活

17、化小膠質(zhì)細(xì)胞分泌IL-1β、IL-6，而可能通過(guò)通過(guò)調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，影響鈣離子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來(lái)抑制炎癥因子分泌。另外，PK11195和Ro5-4864影響IL-1β和IL-6 mRNA的穩(wěn)定性，加快IL-1β和IL-6 mRNA降解，縮短IL-1β和IL-6 mRNA半衰期，從而減少IL-1β和IL-6蛋白的含量。⒂在影響小膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度方面，PK11195和Ro5-4864的作用是相反的。PK11195能顯著地