細(xì)菌感染誘導(dǎo)神經(jīng)炎癥中星形膠質(zhì)細(xì)胞活化及死亡的分子機(jī)制研究.pdf

1、目的：中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病表現(xiàn)為腦或脊髓遭受細(xì)菌入侵而產(chǎn)生的一系列臨床癥狀，是神經(jīng)科常見的疾病之一。其中細(xì)菌性腦膜炎(bacterial meningitis,BM)發(fā)病迅速，需要及時(shí)明確診斷實(shí)施有效的抗生素治療，然而在臨床實(shí)踐中，BM的診斷金標(biāo)準(zhǔn)腦脊液細(xì)菌培養(yǎng)陽性率低、耗費(fèi)時(shí)間長，難以滿足臨床需要。不僅如此，BM患者往往罹患認(rèn)知記憶功能損害、聽力下降等后遺癥，臨床尚無有效治療方法，給患者及社會帶來巨大負(fù)擔(dān)，因此，早期明確診斷及控制晚

2、期后遺癥是神經(jīng)科醫(yī)生迫切需要解決的兩大難題。
　　降鈣素原(Procalcitonin, PCT)是細(xì)菌感染特異性誘導(dǎo)因子，組織細(xì)胞如脂肪細(xì)胞等受到細(xì)菌及細(xì)菌成分如內(nèi)毒素脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)刺激時(shí)均可表達(dá)釋放PCT入血，因此血清PCT是外周細(xì)菌感染、膿毒血癥等良好診斷標(biāo)志物。然而腦內(nèi)細(xì)胞受到細(xì)菌及LPS刺激后是否也存在類似PCT的表達(dá)及分泌卻尚不明確。已知腦內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞在細(xì)菌及LP

3、S刺激下明顯活化增生，伴有炎性因子等多種蛋白表達(dá)增多，因此，我們擬首先探討腦內(nèi)細(xì)胞在細(xì)菌及LPS刺激下PCT表達(dá)與分泌情況，為PCT作為腦內(nèi)細(xì)菌感染診斷標(biāo)志物提供理論基礎(chǔ)。
　　既往已有大量文獻(xiàn)證實(shí)BM患者后遺癥的發(fā)生與腦內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞所介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥網(wǎng)絡(luò)過度放大有關(guān)。作為腦內(nèi)含量最豐富的膠質(zhì)細(xì)胞，在細(xì)菌感染過程中，星形膠質(zhì)細(xì)胞迅速增殖活化，對于放大神經(jīng)炎癥網(wǎng)絡(luò)發(fā)揮了最為關(guān)鍵的作用。因此，通過凋亡或生長周期阻滯減少過度活化的星形膠質(zhì)細(xì)

4、胞數(shù)目是調(diào)控神經(jīng)炎癥網(wǎng)絡(luò)的有效方法。在腫瘤領(lǐng)域研究中發(fā)現(xiàn)，生長阻滯特異性蛋白1(Growth arrest specific1, Gas1)可以抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，近期有研究證明腦內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)Gas1，但功能尚不明確，那么，Gas1是否參與了星形膠質(zhì)細(xì)胞的命運(yùn)調(diào)控？我們進(jìn)一步探索Gas1在活化星形膠質(zhì)細(xì)胞命運(yùn)的調(diào)控作用以及可能的信號通路。
　　本研究借助細(xì)菌感染過程中重要的致炎成分LPS建立神經(jīng)炎癥模型，研究星形膠質(zhì)

5、細(xì)胞的活化、PCT的表達(dá)分泌，及活化星形膠質(zhì)細(xì)胞的命運(yùn)問題。
　　方法：首先建立肺炎鏈球菌及LPS腦內(nèi)注射神經(jīng)炎癥模型，通過免疫熒光雙標(biāo)記染色、western blot及Elisa觀察腦內(nèi)PCT的時(shí)空表達(dá)特點(diǎn)及腦脊液血清PCT含量變化，體外判斷星形膠質(zhì)細(xì)胞PCT的表達(dá)及分泌。然后觀察LPS腦內(nèi)注射神經(jīng)炎癥模型活化星形膠質(zhì)細(xì)胞Gas1的表達(dá)及細(xì)胞凋亡情況，體外通過LPS及炎性因子刺激原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞，利用Brdu摻入實(shí)驗(yàn)、流式

6、細(xì)胞術(shù)、CCK8、LDH釋放實(shí)驗(yàn)、ROS檢測、Tunel等方法觀察細(xì)胞周期、細(xì)胞活力、凋亡等變化及與Gas1表達(dá)的關(guān)系，進(jìn)一步設(shè)計(jì)針對Gas1的siRNA序列干擾活化星形膠質(zhì)細(xì)胞Gas1的表達(dá)，判斷Gas1對活化星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響，通過western blot方法分析Gas1胞內(nèi)信號通路。
　　結(jié)果：
　　1.肺炎鏈球菌及LPS腦內(nèi)注射神經(jīng)炎癥模型海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞明顯活化，伴有PCT表達(dá)顯著升高，CSF PCT

7、含量升高，同時(shí)海馬神經(jīng)元及CSF中滲入的中性粒細(xì)胞陽性表達(dá)PCT。
　　2.人腦海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)元存在PCT陽性表達(dá)。
　　3.LPS腦內(nèi)注射誘導(dǎo)活化星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡數(shù)目明顯增多，伴有Gas1表達(dá)升高。
　　4.體外單純LPS刺激對星形膠質(zhì)細(xì)胞活力無明顯作用，LPS+IFNγ+TNFα聯(lián)合刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞，細(xì)胞氧化應(yīng)激水平明顯升高，細(xì)胞凋亡增多，細(xì)胞生長周期阻滯，伴有Gas1表達(dá)升高。
　　5.siRNA敲

8、低活化星形膠質(zhì)細(xì)胞Gas1表達(dá)水平，導(dǎo)致LPS+IFNγ+TNFα聯(lián)合刺激下星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡減少，但是細(xì)胞周期阻滯無明顯改善。
　　6.Gas1通過增高活化星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)Bax/Bcl2比例，激活caspase-3的表達(dá)促進(jìn)活化星形膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡，對炎性信號通路、細(xì)胞增殖蛋白表達(dá)無明顯作用。
　　結(jié)論：
　　1.證明了大鼠及人腦內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞PCT的表達(dá)，在LPS及肺炎鏈球菌刺激下活化星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)PCT明顯增多，C

9、SF PCT含量升高，提示PCT可能是腦內(nèi)細(xì)菌感染診斷標(biāo)志物(Figure1)。
　　2.發(fā)現(xiàn)LPS誘導(dǎo)神經(jīng)炎癥中活化星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡增多，細(xì)胞周期阻滯，伴有Gas1表達(dá)升高，說明了活化星形膠質(zhì)細(xì)胞通過凋亡及細(xì)胞增殖阻滯的方式減少細(xì)胞數(shù)目。
　　3.明確了Gas1在活化星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡中的作用，干擾 Gas1的表達(dá)可以導(dǎo)致活化星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡減少，但是細(xì)胞周期阻滯無明顯改善，提示Gas1可以作為調(diào)控活化星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而