炎性因子活化星形膠質(zhì)細胞對T細胞調(diào)節(jié)機制研究.pdf

1、緊密的血腦屏障(blood-brainbarrier,BBB)和免疫抑制微環(huán)境的存在使中樞神經(jīng)系統(tǒng)(centralnervoussystem，CNS)一直被認為是免疫特赦區(qū)。但在腦外傷、炎癥等情況下，白細胞可通過破壞的BBB進入腦內(nèi)。大量研究顯示，CNS內(nèi)存在特異性的T細胞免疫應(yīng)答，在抗微生物感染、多發(fā)性硬化癥、自身免疫性腦炎以及腦血管病等多種疾病中發(fā)揮重要作用。然而，由于腦實質(zhì)內(nèi)缺乏淋巴管引流和對啟動免疫應(yīng)答起重要作用的專職抗原提呈細

2、胞(antigen-presentingcell,APC)，初始T細胞被抗原活化的啟動過程可能主要在外周淋巴器官中完成，而活化的T細胞或致敏的T細胞穿過BBB后，被CNS內(nèi)的APC再次激活，從而發(fā)揮免疫效應(yīng)。此外，在CNS內(nèi)的特殊微環(huán)境中，由于T細胞活化后存活期短、增殖能力弱以及接受再刺激時的快速凋亡，使得活化后T細胞的效應(yīng)維持機制顯得尤為重要。目前，CNS內(nèi)的膠質(zhì)細胞如何參與T細胞免疫應(yīng)答過程及其作用地位已成為神經(jīng)免疫領(lǐng)域倍受關(guān)注的問

3、題之一。 星形膠質(zhì)細胞(Astrocytes,Ast)作為大腦內(nèi)最多的細胞群，發(fā)揮著維持大腦微環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要生理功能，而其神經(jīng)免疫功能往往被忽視，一般認為小膠質(zhì)細胞才是腦內(nèi)行使免疫呈遞和免疫調(diào)控功能的細胞。但是最近的研究證實，星形膠質(zhì)細胞可以表達免疫膜分子，分泌炎性因子和釋放補體等，參與腦內(nèi)炎性疾病的發(fā)生發(fā)展，從而逐漸受到神經(jīng)免疫學者的關(guān)注和重視。星形膠質(zhì)細胞能夠維持大腦的免疫穩(wěn)態(tài)，除通過血腦屏障中豐富的足突結(jié)構(gòu)形成機械屏障以外

4、，可能還存在有生物學屏障，如免疫抑制性分子的存在和分泌抑制性細胞介質(zhì)發(fā)揮免疫保護效應(yīng)。提示星形膠質(zhì)細胞有可能成為CNS內(nèi)免疫效應(yīng)細胞，參與腦內(nèi)炎性調(diào)控作用。研究證實，星形膠質(zhì)細胞對內(nèi)環(huán)境改變?nèi)缪仔源碳ぁ⑷毖?、缺氧以及腦外傷等有高度敏感性，將出現(xiàn)反應(yīng)性的改變，通常稱為“活化”或“膠質(zhì)化”，即星形膠質(zhì)細胞在炎性病變中的可塑性變化。已有研究報道證實星形膠質(zhì)細胞在受到炎性介質(zhì)的刺激后，血腦屏障的通透性增加，易于T細胞浸潤，參與疾病進程。在體通過

5、EAE模型證實活化后的星形膠質(zhì)細胞具有抗原處理、提呈功能，可以再次活化T淋巴細胞，加劇疾病的發(fā)展。因此，星形膠質(zhì)細胞在CNS內(nèi)T細胞活化后效應(yīng)以及對T細胞功能的調(diào)控顯得極為重要，但這一過程中涉及到CNS內(nèi)的細胞和T淋巴細胞作用的分子機制目前尚不確切。 T細胞活化及效應(yīng)維持不僅需要TCR與MHC-抗原肽復(fù)合物作用作為活化第一信號，同時需要APC表達共刺激分子提供第二信號。正常生理情況下，少量的T細胞進入腦內(nèi)，由于缺乏共刺激信號或受

6、到腦內(nèi)細胞的抑制性作用，識別抗原后的T細胞會失能或死亡。基于以上認識，針對CNS內(nèi)T細胞活化后效應(yīng)維持的分子機制，星形膠質(zhì)細胞作為維持CNS穩(wěn)態(tài)最重要的神經(jīng)細胞，是否具有免疫效應(yīng)功能，受到炎癥細胞因子刺激后，其免疫功能的變化，特別是調(diào)控T細胞的增殖、凋亡和分化中的作用及其機制目前尚無定論。本課題旨在探討炎癥因子刺激星形膠質(zhì)細胞活化前后對T細胞的增殖凋亡和T細胞分泌細胞因子的影響，深入認識星形膠質(zhì)細胞的免疫功能，為防治CNS內(nèi)炎性疾病提供

7、實驗依據(jù)。 本課題研究的內(nèi)容和結(jié)果如下 1.為建立穩(wěn)定的星形膠質(zhì)細胞活化模型，采用炎性刺激因子LPS(500ng/ml)、m-IFN-γ(100U/ml)處理培養(yǎng)純化小鼠星形膠質(zhì)細胞，通過CLSM檢測到細胞內(nèi)鈣的反應(yīng)性升高，ELISA方法檢測顯示星形膠質(zhì)細胞活化后分泌TNF-α和NO，表明LPS和m-IFN-γ聯(lián)合刺激有促進分泌的作用； 2.了解活化前后星形膠質(zhì)細胞生理功能的改變，利用RT-PCR檢測星形膠質(zhì)細胞

8、中興奮性谷氨酸的轉(zhuǎn)運體GLT1和代謝酶GS的mRNA水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)活化后星形膠質(zhì)細胞GLT1和GS的表達上調(diào)； 3.探討星形膠質(zhì)細胞的免疫功能，利用RT-PCR、免疫組化、免疫熒光和FACS方法檢測原代星形膠質(zhì)細胞或細胞株(CRL-2541)的免疫膜分子B7-H1、B7.1、B7.2、MHCII的基因和蛋白表達，結(jié)果顯示星形膠質(zhì)細胞組成性表達抑制性的免疫分子B7-H1，活化后表達下降；B7.2在mRNA水平組成性表達，活化后的星

9、形膠質(zhì)細胞均轉(zhuǎn)錄和表達B7.1、B7.2、MHCII分子，同時細胞因子TNF-α對免疫膜分子表達具有促進作用； 4.研究星形膠質(zhì)細胞對T細胞增殖凋亡的影響，密度梯度離心法和尼龍毛法分離獲得較高純度的小鼠脾臟T細胞，ConA(50μg/ml)活化T細胞后通過接觸或Transwell非接觸模式與靜息/活化的星形膠質(zhì)細胞進行共培養(yǎng)，CCK-8檢測細胞增殖，F(xiàn)ITC-AnnexinV/PI熒光染色后檢測T細胞凋亡和壞死，發(fā)現(xiàn)靜息的星形膠

10、質(zhì)細胞接觸抑制T細胞增殖，經(jīng)FITC-AnnexinV/PI熒光染色后檢測受抑制的T細胞存在有大量的凋亡和壞死細胞；而活化后的星形膠質(zhì)細胞的抑制功能下降；采用Tanswell的非接觸培養(yǎng)模式可檢測到星形膠質(zhì)細胞對T細胞也有抑制作用； 5.為了解星形膠質(zhì)細胞對T淋巴細胞分泌細胞因子的影響，利用ELISA方法檢測細胞因子IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10，結(jié)果顯示活化前后的星形膠質(zhì)細胞通過接觸和非接觸共培養(yǎng)模式均能抑制細胞因

11、子IL-2、IFN-γ的分泌，而IL-4、IL-10的分泌變化不明顯。Transwell的非接觸模型比較發(fā)現(xiàn)活化前后星形膠質(zhì)細胞均能抑制T細胞增殖，提示星形膠質(zhì)細胞不僅存在膜分子的抑制作用，還存在有可溶性分泌因子的抑制作用。結(jié)論： 本研究結(jié)果表明：1)LPS和IFN-γ能夠刺激星形膠質(zhì)細胞活化，影響細胞在CNS的生理功能；2)正常靜息的星形膠質(zhì)細胞抑制T細胞增殖、促進其凋亡在維持大腦免疫豁免區(qū)中發(fā)揮重要作用，其機制可能與細胞表達

12、抑制性的免疫分子B7-H1和分泌抑制性介質(zhì)有關(guān)；3)炎性刺激活化后的星形膠質(zhì)細胞分泌炎性因子、表達免疫共刺激分子B7.1、B7.2、MHCII，對T細胞抑制功能削弱，可能是腦內(nèi)T細胞浸潤和增殖加強的原因之一；4)星形膠質(zhì)細胞對Thl細胞因子IL-2、IFN-γ分泌抑制作用提示星形膠質(zhì)細胞在腦內(nèi)調(diào)控Th1/Th2的平衡具有一定作用，影響炎性疾病的發(fā)展。由此可見，星形膠質(zhì)細胞具有免疫調(diào)控作用，特別是在神經(jīng)疾病中對T細胞增殖抑制，以維持中樞神