羧甲司坦單用或聯(lián)合布地奈德對(duì)COPD氣道炎癥和氧化應(yīng)激水平的影響.pdf

1、目的：
　　慢性阻塞性肺疾病(COPD)是全球范圍內(nèi)的主要致死病因之一，嚴(yán)重危害人類健康。如何有效地治療COPD，特別是減少COPD急性發(fā)作的頻次，對(duì)于肺功能的保護(hù)和患者預(yù)后都有重要的意義。
　　羧甲司坦(S-CMC)是一種臨床常用的黏液調(diào)節(jié)劑。已有大量的基礎(chǔ)和臨床研究證實(shí)，羧甲司坦的抗炎、抗氧化作用比其本身的祛痰作用更為顯著。一項(xiàng)由鐘南山院士和康健教授牽頭的隨機(jī)雙盲對(duì)照研究(PEACE Study)顯示，長期規(guī)律口服羧甲司

2、坦能夠預(yù)防慢阻肺的急性加重。但國外一些研究與之尚存在分歧。分析其異同發(fā)現(xiàn)，基礎(chǔ)應(yīng)用糖皮質(zhì)激素可能對(duì)羧甲司坦的抗炎、抗氧化作用存在影響。
　　目前國內(nèi)外雖然有較多關(guān)于黏液調(diào)節(jié)劑治療COPD的基礎(chǔ)和臨床研究，但研究者的興趣點(diǎn)均在于此類藥物是否有效，而忽視了在何種狀態(tài)下有效。本研究旨在通過比較羧甲司坦單用或聯(lián)合吸入性糖皮質(zhì)激素的療效證實(shí)羧甲司坦能夠改善COPD氣道炎癥和氧化應(yīng)激水平，并探討吸入糖皮質(zhì)激素對(duì)羧甲司坦上述作用的影響機(jī)制，為羧

3、甲司坦在COPD治療中的應(yīng)用提供重要的理論依據(jù)。
　　材料和方法：
　　一、體內(nèi)實(shí)驗(yàn):羧甲司坦對(duì)慢性阻塞性肺疾病大鼠氣道炎癥和氧化應(yīng)激水平的影響
　　1、COPD大鼠模型的制備
　　SPF級(jí)雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為5組:對(duì)照組（N組）、熏煙組(CN組)、羧甲司坦組（CC組）、布地奈德組（CB組）、聯(lián)合組（CCB組），每組10只。對(duì)照組（N組）:正常飼養(yǎng);其余4組慢性熏煙刺激12周，采用自制吸煙染毒箱（玻璃制成

4、，體積0.8×0.6×0.6m3，箱頂留有2個(gè)2×2cm2通氣孔），燃燒紅金龍牌香煙，由三通管導(dǎo)入煙霧，一次熏煙12支，煙霧濃度約5％，0.5h/次，2次/天，5天/周。造模成功后分別加干預(yù)因素（CN組每日霧化生理鹽水30ml; CB組每日霧化布地奈德1mg/kg; CC組每日給予羧甲司坦500mg/kg灌胃;CCB組同時(shí)給予以上兩種藥物）4周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
　　2、肺功能測定
　　水合氯醛腹腔注射麻醉，采用Medlab醫(yī)學(xué)軟

5、件分析系統(tǒng)測定各組大鼠PEF、FEV0.3/FVC％。
　　3、留取血清、BALF、肺組織標(biāo)本
　　水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，眼球取血，離心后收集血清保存待檢。行氣管插管，以生理鹽水反復(fù)灌洗左肺收集BALF，留做細(xì)胞分類計(jì)數(shù)。將左肺組織固定于4％多聚甲醛中，制作石蠟切片用于組織病理和免疫組織化學(xué)檢測。右肺組織置-80℃保存用于Western-blot和Real-time PCR檢測。
　　4、石蠟切片HE染色
　

6、　制作大鼠肺組織石蠟切片并行HE染色評(píng)價(jià)病理形態(tài)學(xué)改變，應(yīng)用顯微圖像分析系統(tǒng)定量分析肺平均內(nèi)襯間隔(MLI)、平均肺泡數(shù)(MAN)。
　　5、免疫組織化學(xué)染色
　　免疫組織化學(xué)染色比較各組大鼠肺組織TNF-α、NF-κB、IκBα的表達(dá)。
　　6、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)
　　檢測大鼠血清及肺組織勻漿的TNF-α、IL-8、IL-6水平。
　　7、氧化應(yīng)激
　　檢測大鼠血清SOD、MDA水平。<

7、br>　　8、蛋白印跡實(shí)驗(yàn)(Westem-Blot)
　　檢測大鼠肺組織NF-κB、ERK1/2蛋白的表達(dá)。
　　9、實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈法(Real-time PCR)
　　檢測大鼠肺組織NF-κB、ERK1/2 mRNA表達(dá)。
　　二、體外實(shí)驗(yàn):羧甲司坦對(duì)人氣道上皮細(xì)胞炎癥及氧化應(yīng)激水平的影響及其調(diào)控機(jī)制
　　1、人氣道上皮細(xì)胞株(16HBE細(xì)胞)培養(yǎng)
　　2、煙霧提取物(CSE)的制備:制

8、備的CSE濃度設(shè)定為100％，稀釋不同濃度的CSE30min內(nèi)用于實(shí)驗(yàn)。
　　3、MTT法檢測不同濃度CSE對(duì)細(xì)胞生存率的影響:分別加入不同濃度(80％、40％、20％、10％、5％、2.5％、1.25％、0.63％、0％) CSE于干預(yù)后1h、3h、6h、12h、24h、48h處理細(xì)胞。
　　4、分7組給予藥物干預(yù):(1)對(duì)照組（N組）;(2)模型組（CN組）:CSE;(3)羧甲司坦組（CC組）: CSE+羧甲司坦;(4)

9、布地奈德組（CB組）:CSE+布地奈德;(5)聯(lián)合組（CCB組）:CSE+布地奈德+羧甲司坦;(6)抑制劑組（CNP組）: CSE+ PD98059;(7)激動(dòng)劑組（CCE組）:CSE+羧甲司坦+EGF。
　　5、ELISA法檢測炎癥因子IL-8、IL-6水平的變化。
　　6、氧化應(yīng)激水平檢測:Fe3+還原法測定血漿總抗氧化能力(T-AOC)，DTNB法測定谷胱甘肽(GSH)含量。
　　7、Western-Blot方法

10、檢測ERK、P-ERK、IκBα、P-IκBα蛋白水平的變化。
　　8、Real-time PCR方法檢測ERK1/2、NF-κBmRNA水平的變化。
　　結(jié)果：
　　一、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)部分
　　1、病理及肺功能改變
　　組織病理學(xué)提示CN組肺泡腔擴(kuò)張，肺泡壁斷裂，部分肺泡融合形成肺大皰，并伴有炎性細(xì)胞浸潤，MLI增加，MAN降低，肺功能檢測FEV0.3/FVC＜70％，符合COPD診斷，證明COPD大鼠模型造模

11、成功。CC組、CB組和CCB組病理及肺功能均較CN組有所改善。
　　2、TNF-α、NF-κB、IκBα免疫組化染色
　　與N組比較，CN組大鼠氣道上皮、肺泡間隔及巨噬細(xì)胞漿內(nèi)TNF-α陽性表達(dá)增加，胞漿及胞核內(nèi)NF-κB陽染增多，其余三組較CN組減輕。IκBα免疫組化染色與NF-κB結(jié)果相反。
　　3、BALF細(xì)胞分類計(jì)數(shù)
　　與N組相比，CN組大鼠BALF細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞百分比明顯升高，巨噬細(xì)胞百分比明顯

12、降低，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;CC組BALF細(xì)胞總數(shù)及中性粒細(xì)胞百分比較CN組有所降低。
　　4、炎癥因子和氧化應(yīng)激水平
　　與N組相比，CN組TNF-α、IL-8、IL-6、MDA水平明顯升高，SOD水平降低，CC組、CB組及CCB組較CN組改善，給藥三組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　5、NF-κB、ERK1/2蛋白和mRNA的表達(dá)
　　與N組相比，CN組NF-κB、ERK1/2蛋白和mRNA的表達(dá)明顯增高，CC組、CB

13、組及CCB組較CN組降低，給藥三組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　二、體外實(shí)驗(yàn)部分
　　1、隨著CSE濃度的升高，HBE細(xì)胞的生存率呈下降趨勢。CSE濃度在10％-80％之間，隨著作用時(shí)間延長，細(xì)胞生存率明顯降低。
　　2、CN組IL-8、IL-6水平均較N組明顯升高，CC組、CB組及CCB組上述指標(biāo)較CN組有所降低，但此三組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　3、CN組GSH、T-AOC水平均較對(duì)照組明顯降低，CC組、CB組及CCB組

14、上述指標(biāo)均較CN組有所升高。
　　4、與N組相比，CN組P-ERK、P-Iκ Bα蛋白表達(dá)明顯增高;CC組、CB及CCB組上述指標(biāo)較CN組明顯降低。給予PD98059干預(yù)后P-ERK明顯降低，給予EGF干預(yù)后P-ERK較CC組有所回升。
　　5、與N組比較，CN組細(xì)胞ERK、NF-κBmRNA表達(dá)均明顯增高;CC組、CB組及CCB組上述指標(biāo)較CN組均明顯降低。
　　結(jié)論：
　　1、被動(dòng)熏煙12周成功復(fù)制出COPD