羧甲司坦對(duì)慢性被動(dòng)吸煙大鼠氣道細(xì)菌負(fù)荷的影響及相關(guān)機(jī)制的研究.pdf

1、目的：
　　 慢性阻塞性肺疾病(COPD)在病程進(jìn)展中常伴有急性發(fā)作,加速肺功能的下降,增加經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和病死率。69.6％的急性發(fā)作與細(xì)菌感染有關(guān)。
　　 宿主局部炎癥反應(yīng)與氣道細(xì)菌負(fù)荷量的增加成正比。2002年Miravitlles提出了COPD急性細(xì)菌感染的“閾值理論”。他認(rèn)為,出現(xiàn)急性發(fā)作的前提是氣道內(nèi)的細(xì)菌負(fù)荷必須達(dá)到某最小閾值。影響COPD急性發(fā)作細(xì)菌閾值水平的因素有內(nèi)在因素(肺功能受損、重度吸煙、氣道高反應(yīng)性、

2、氣道黏液高分泌和防御機(jī)制受損)和外在因素(細(xì)菌種類、干燥低溫環(huán)境、空氣污染和穩(wěn)定期和急性發(fā)作期處理不當(dāng))。粘液纖毛清除功能是氣道的非特異性防御機(jī)制,可以通過粘液纖毛清除系統(tǒng)清除病原菌,減低氣道的細(xì)菌負(fù)荷。
　　 羧甲司坦是經(jīng)典的粘痰溶解劑,最新的體外研究證實(shí)其具有抗炎抗氧化特性,它可以清除ROS；并可抑制NE引起的粘蛋白的產(chǎn)生和抑制鼻病毒感染；它可以減少細(xì)菌粘附率,其抗細(xì)菌粘附特性與粘蛋白相關(guān)性很強(qiáng)。我們前期的PEACE研究表明

3、[2],中至重度COPD病人口服羧甲司坦或安慰劑一年,羧甲司坦組可有效減少急性發(fā)作的次數(shù),但其確切的機(jī)制還不清楚。本研究在體首次探討了羧甲司坦對(duì)慢性吸煙大鼠氣道的細(xì)菌負(fù)荷的關(guān)系,并從MUC5AC粘附細(xì)菌和MCC清除細(xì)菌功能方面探討了相關(guān)機(jī)制。本研究旨在為羧甲司坦的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.COPD鼠模型的制備
　　 SPF級(jí)雄性Wistar大鼠96只隨機(jī)分為4組,每組24只。A組正常對(duì)照組:

4、正常飼養(yǎng)12周；B組COPD組:慢性被動(dòng)吸煙12周,自制被動(dòng)吸煙玻璃熏箱(0.8×0.6×0.6m3),箱頂留有2×2cm2的通氣孔,燃燒大前門牌香煙,由三通管導(dǎo)入煙霧。一次熏煙燃燒大前門香煙12支,煙霧濃度約5％,持續(xù)0.5小時(shí),每日吸煙2次,上下午各一次,每周5天,連續(xù)12周。C組羧甲司坦預(yù)防組:除吸煙外,從第1周起,羧甲司坦500mg/kg于吸煙日熏煙前半小時(shí)灌胃；D組羧甲司坦治療組:除吸煙外,從第6周起,羧甲司坦500mg/kg

5、于吸煙日熏煙前半小時(shí)灌胃。
　　 2.月市功能測定
　　 戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉,將各組大鼠應(yīng)用AniRes2005動(dòng)物肺功能分析系統(tǒng)(北京貝蘭博科技有限公司)檢測0.3秒率。
　　 3.肺組織切片和BALF液的留取
　　 肺組織放入4％多聚甲醛中固定石蠟包埋切片用于組織化學(xué)和免疫組織化學(xué)檢測。其余右肺組織置.800c保存用于PCR和Wester-blot檢測。
　　 4.阿辛藍(lán).過碘酸雪夫染色(

6、AB-PAS)
　　 石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟至水后行AB-PAS染色以評(píng)價(jià)粘液樣物質(zhì)的表達(dá)和杯狀細(xì)胞增生。
　　 5.免疫組織化學(xué)染色
　　 SABC法Muc5ac免疫組化檢測用于測定Muc5ac陽染細(xì)胞數(shù)和Muc5ac表達(dá)的多少。
　　 6.實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈(RT-PCR)法
　　 檢測大鼠氣道Muc5acmRNA表達(dá)。
　　 7.蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)(Western Blot):檢測大

7、鼠氣道Muc5ac蛋白的表達(dá)。
　　 8.閃爍照相技術(shù)測定大鼠的粘液纖毛清除功能
　　 測定口咽滴入99mTc-Sc清除過程,作為評(píng)價(jià)大鼠的粘液纖毛清除功能
　　 9.大鼠肺部接種Hi后細(xì)菌負(fù)荷的測定
　　 12周后各組大鼠氣管內(nèi)接種定量的流感嗜血桿菌混懸液,3h后無菌取BALF和肺,BALF液和肺組織勻漿后計(jì)數(shù)細(xì)菌菌落為細(xì)菌負(fù)荷。
　　 結(jié)果：
　　 1.COPD鼠模型確立
　　

8、 肺組織病理學(xué)檢測示B組有一定數(shù)量的炎細(xì)胞浸潤并伴有肺泡壁破裂肺泡融合,肺泡腔擴(kuò)大,肺功能檢測FEV0.3/FVC<70％,符合COPD診斷。
　　 C組和D組少許炎細(xì)胞浸潤,僅有部分肺泡壁破裂融合、肺泡腔擴(kuò)大,FEV0.3/FVC也有改善。
　　 2.大鼠氣道Muc5ac表達(dá)和杯狀細(xì)胞化生
　　 B組存在著粘液高分泌即Muc5ac表達(dá)上調(diào)和杯狀細(xì)胞化生增加,P<0.05。
　　 3.大鼠氣道的細(xì)菌負(fù)荷<

9、br>　　 B組大鼠氣道的細(xì)菌負(fù)荷較A組升高,C組和D組經(jīng)羧甲司坦干預(yù)后細(xì)菌負(fù)荷降低,P<0.05。
　　 4.粘液纖毛清除功能測定
　　 較對(duì)照A組相比,B組粘液纖毛清除系統(tǒng)功能的下降,C組和D組粘液纖毛清除系統(tǒng)功能改善,P<0.05。且C組的改善作用更為明顯。
　　 結(jié)論：
　　 1.被動(dòng)熏煙12周復(fù)制出COPD鼠模型。
　　 2.羧甲司坦降低了慢性阻塞性肺疾病大鼠氣道的細(xì)菌負(fù)荷。
　

10、　 3.羧甲司坦改善了與細(xì)菌粘附和清除相關(guān)的氣道的粘液高分泌和粘液纖毛清除系統(tǒng)功能,這可能是細(xì)菌負(fù)荷降低的機(jī)制。
　　 4.羧甲司坦預(yù)防組效果更優(yōu),可能與其抗氧化作用更充分有關(guān)。
　　 前 言
　　 羧甲司坦是粘痰溶解劑,最新的研究證實(shí)體外具有抗炎抗氧化作用,可有效清除活性氧、羥自由基和谷胱甘肽,且粘液溶解劑減少細(xì)菌粘附率,其抗細(xì)菌粘附特性與粘蛋白相關(guān)性很強(qiáng)。我們前期的體內(nèi)研究證實(shí)羧甲司坦可以減少COPD大鼠氣

11、道的細(xì)菌負(fù)荷并減輕了粘液高分泌狀態(tài),而吸煙可以通過氧化應(yīng)激機(jī)制引起氣道的粘液高分泌,我們推測羧甲司坦可以通過抗氧化機(jī)制抑制粘液高分泌,從而減少了細(xì)菌的粘附而使氣道細(xì)菌負(fù)荷降低。本研究擬檢測羧甲司坦對(duì)吸煙誘導(dǎo)的粘液高分泌的效應(yīng)以及與吸煙誘導(dǎo)粘蛋白產(chǎn)生相關(guān)的ROS的產(chǎn)生量。
　　 方法：
　　 NCI-H292細(xì)胞,人類粘液表皮細(xì)胞癌細(xì)胞系,處理因素是吸煙和羧甲司坦。以EGFR和ERK特異性抑制劑AG1478和PD98059

12、為干預(yù)條件。采用RT-PCR、ELISA和Western-blotting技術(shù)觀察培養(yǎng)細(xì)胞黏蛋白MUC5ACmRNA、MUC5AC蛋白的表達(dá),測定了細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)量和以及EGFR和磷酸化EGFR和ERK的量。
　　 結(jié)果：
　　 羧甲司坦減少了吸煙誘導(dǎo)的MUC5ACmRNA和蛋白的表達(dá),羧甲司坦也減少了吸煙誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)量。羧甲司坦減少了p-EGFR和p-ERK蛋白的產(chǎn)生。
　　 結(jié)論：
　　 羧