高血脂狀態(tài)下hepcidin高表達(dá)對血管內(nèi)皮損傷的影響及川芎嗪的干預(yù)機(jī)制研究.pdf

1、動脈粥樣硬化(AS)是由多種因素導(dǎo)致的慢性血管性疾病，內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙是AS的始動環(huán)節(jié)，保護(hù)血管內(nèi)皮對于AS的早期防治意義重大。隨著鐵代謝與AS的相關(guān)性研究逐漸增多，鐵在AS進(jìn)展中的促進(jìn)作用已得到證實(shí)。
　　本研究通過構(gòu)建高脂血癥大鼠模型，觀察高血脂狀態(tài)對大鼠血清鐵調(diào)素(hepcidin)表達(dá)的影響，以及抑制hepcidin表達(dá)后血管內(nèi)皮損傷程度的變化情況;為明確hepcidin異常表達(dá)與內(nèi)皮損傷的相關(guān)性，借助hepcidin調(diào)控

2、子膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(FPN1)基因內(nèi)皮敲除(FPN1 Tek-cre)小鼠模型，與同品系小鼠C57BL/6對照觀察FPN1 Tek-cre小鼠的內(nèi)皮損傷程度及功能變化;并在高血脂狀態(tài)下進(jìn)一步觀察hepcidin上游通路p-Stat3蛋白與p-Smad1/5/8蛋白表達(dá)量的變化;并觀察川芎嗪干預(yù)后上述模型的內(nèi)皮損傷、鐵代謝及hepcidin相關(guān)通路等指標(biāo)的變化，以期以明確hepcidin參與AS的機(jī)制及川芎嗪的干預(yù)效應(yīng)，為AS的發(fā)病機(jī)理研究

3、及活血化瘀中藥抗AS的作用機(jī)制研究提供新的思路及科學(xué)依據(jù)。
　　本課題研究包括以下兩部分:文獻(xiàn)綜述和實(shí)驗(yàn)研究。
　　1.文獻(xiàn)綜述:本部分從“動脈粥樣硬化與血管內(nèi)皮損傷機(jī)制研究進(jìn)展”、“鐵代謝與斑塊穩(wěn)定性的相關(guān)研究進(jìn)展”和“Hepcidin的生物學(xué)效應(yīng)”三個方面進(jìn)行綜述。
　　2.實(shí)驗(yàn)研究:包括以下三個部分。
　　研究一 高脂血癥大鼠hepcidin表達(dá)變化對內(nèi)皮功能的影響
　　目的:探討高脂血癥大鼠hepc

4、idin表達(dá)變化對內(nèi)皮功能的影響。
　　方法:24只SD大鼠隨機(jī)分為4組:空白對照組(N)、高脂模型組(M)、肝素組(MH)及川芎嗪組(MT)，每組6只。除空白對照組以普通飼料喂養(yǎng)外，其余3組均以高脂飼料喂養(yǎng)。8周后，N組及M組給予生理鹽水2 ml/(kg·d)，MH組和MT組分別給予肝素鈉5mg/(kg·d)、鹽酸川芎嗪注射液40mg/(kg·d)腹腔注射，連續(xù)7天。注射7天后，所有大鼠禁食不禁水8h，腹主動脈取血后分離血清，生

5、化法檢測各組血脂，ELISA法檢測血清鐵調(diào)素(Hepcidin)、白細(xì)胞介素1(IL-1)、白細(xì)胞介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、一氧化氮(NO)、內(nèi)皮素1(ET-1)、活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)、過氧化氫酶(CAT)及超氧化物歧化酶(SOD)的表達(dá)。
　　結(jié)果:與N組相比，M組、MH組及MT組的血脂水平均顯著升高（P＜0.05）;M組血清hepcidin、IL-1、IL-6、TNF-α、ET-1、RO

6、S、MDA含量均有不同程度升高(P＜0.05)，NO與SOD及CAT降低（P＜0.05）。與M組相比，MH組和MT組血清hepcidin、IL-1、IL-6、TNF-α、ET-1、ROS、MDA含量均有降低(P＜0.05，P＜0.01)，但MH組下降更為明顯，而給藥兩組NO及CAT升高(P＜0.05)，其中SOD有升高趨勢，但組間比較無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　結(jié)論:隨著血脂水平升高，hepcidin呈高表達(dá)趨勢，伴隨著大鼠血管內(nèi)皮損傷程

7、度加重，同時炎癥因子表達(dá)增加，抗氧化能力下降，內(nèi)皮功能紊亂。在應(yīng)用肝素干預(yù)后，血脂水平雖沒有下降，但是hepcidin表達(dá)水平下降，大鼠血管內(nèi)皮損傷程度減輕，炎癥因子表達(dá)降低，抗氧化能力有所改善，川芎嗪與肝素有類似作用，故推測川芎嗪對內(nèi)皮的保護(hù)機(jī)制可能與其對hepcidin高表達(dá)的抑制作用有關(guān)。
　　研究二 高血脂狀態(tài)下FPN1基因敲除后小鼠內(nèi)皮功能的變化
　　目的:通過構(gòu)建高脂血癥模型觀察FPN1基因內(nèi)皮敲除對小鼠內(nèi)皮功能

8、、氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)的影響以及川芎嗪的干預(yù)效應(yīng)。
　　方法:80只FPN1 Tek-cre小鼠與40只C57BL/6小鼠均為雌雄各半，分別隨機(jī)分組，每組20只，共6組，1組C57BL/6小鼠與2組FPN1Tek-cre小鼠以普通飼料喂養(yǎng)4周，剩余3組以高脂飼料喂養(yǎng)4周，建立高脂血癥模型。喂養(yǎng)4周后，將以普通飼料喂養(yǎng)的小鼠中，C57BL/6小鼠設(shè)為空白對照組(N)，F(xiàn)PN1Tek-cre小鼠隨機(jī)分為FPN1Tek-cre小鼠普食

9、組(FN)及FPN1 Tek-cre小鼠普食川芎嗪組(FNT);以高脂飼料喂養(yǎng)的小鼠中，C57BL/6小鼠設(shè)為高脂模型組(M)，F(xiàn)PN1 Tek-cre小鼠隨機(jī)分為FPN1 Tek-cre小鼠高脂組(FM)及FPN1 Tek-cre小鼠高脂川芎嗪組(FMT)。N、M、FN及FM組給予生理鹽水2 mL/(kg·d)腹腔注射;FNT及FMT組給予鹽酸川芎嗪注射液40mg/(kg·d)腹腔注射，各組注射均連續(xù)7天。各組小鼠在注射藥物7天后，禁

10、食8h，每組各抽取5只小鼠，摘眼球取血置于EDTA抗凝的采血管中，用于檢測CECs的值。剩余各組小鼠摘眼球取血置于促凝采血管中，分離血清，用于各組小鼠生化法檢測血脂、ELISA法檢測Hepcidin、NO、ET-1、ROS、MDA、SOD、IL-1、 IL-6及TNF-α的表達(dá)。取血后分離小鼠主動脈與肝臟，將主動脈上端約0.5cm與肝左葉根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)組織切片技術(shù)，固定于4％多聚甲醛中，用于組織切片及HE染色，主動脈剩余部分放于-80℃冰箱保

11、存，用于組織鐵的檢測。
　　結(jié)果:1.各組小鼠主動脈內(nèi)鐵含量的比較:與N組相比，M組、FM主動脈內(nèi)鐵含量均顯著增多(P＜0.05)，F(xiàn)N組雖有變化的趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.1）;與M組相比，F(xiàn)M組小鼠主動脈內(nèi)鐵含量雖增多的趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.1）;與FM組相比，F(xiàn)MT組小鼠主動脈內(nèi)鐵含量明顯減少（P＜0.01）。
　　2.各組小鼠血脂水平比較:與N組相比，M組、FM組與FMT組小鼠的血清膽固醇(TC)

12、水平均顯著升高（P＜0.05）。與M組相比，F(xiàn)M組與FMT組的TC均無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.1），而各組的TG（甘油三酯）水平均無明顯變化(P＞0.05)。
　　結(jié)論:本研究結(jié)果提示，F(xiàn)PN1基因內(nèi)皮敲除可加重主動脈內(nèi)的鐵過載，引起并加重內(nèi)皮功能障礙、氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)，且在機(jī)體高血脂狀態(tài)下表現(xiàn)更為顯著。高脂血癥狀態(tài)可引起血清hepcidin的表達(dá)增多與組織內(nèi)鐵過載，而川芎嗪可抑制hepcidin的高表達(dá)，減少組織內(nèi)

13、鐵沉積，且對鐵過負(fù)荷的改善作用更加明顯。
　　研究三 高脂血癥小鼠hepcidin基因和肝臟內(nèi)p-Stat3與p-Smad1/5/8表達(dá)變化
　　目的:通過檢測小鼠肝臟中hepcidin基因的上游調(diào)控因子p-Smad1/5/8與p-Stat3的表達(dá)，探討高血脂狀態(tài)下小鼠肝臟p-Stat3與p-Smad1/5/8表達(dá)的變化與川芎嗪干預(yù)作用的機(jī)制。
　　方法:C57BL/6小鼠24只，普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1w后，隨機(jī)分為4組

14、，每組6只，其中2組以普通飼料喂養(yǎng)4周，剩余2組以高脂飼料喂養(yǎng)4周，建立高脂血癥模型。喂養(yǎng)4周后，將以普通飼料喂養(yǎng)的2組小鼠隨機(jī)分為空白對照組(N)及普食川芎嗪組(NT)，以高脂飼料喂養(yǎng)的小鼠隨機(jī)分為高脂模型組(M)及高脂+川芎嗪組(MT)。N及M組給予生理鹽水2 mL/(kg·d)腹腔注射;NT及MT組給予鹽酸川芎嗪注射液40mg/(kg·d)腹腔注射，各組注射均連續(xù)7天。各組小鼠在注射藥物7天后，禁食8h，摘眼球取血分離血清后用于h

15、epcidin與生化的檢測。分離小鼠肝臟，將肝左葉根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)組織切片技術(shù)，固定于4％多聚甲醛中，用于組織切片及HE染色，剩余部分置于凍存管內(nèi)迅速放入液氮中，后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存，用于p-Smad1/5/8與p-Stat3蛋白表達(dá)的檢測。
　　結(jié)果:1.各組小鼠血脂水平比較:與N組相比，NT組的TC的水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.1），而M組及MT組的血清TC均明顯升高（P＜0.01）;與N組相比，各組的TG的水平均無明顯改變（P

16、＞0.1）。
　　2.各組小鼠血清hepcidin的比較:與N組相比，NT組血清hepcidin表達(dá)有減少的趨勢，但差異無顯著統(tǒng)計學(xué)意義（0.1＞P＞0.05），M組血清hepcidin的表達(dá)則增多（P＜0.01）。與M組相比，MT組的血清hepcidin表達(dá)明顯減少(P＜0.01)。
　　結(jié)論:高血脂狀態(tài)下p-Stat3蛋白表達(dá)量增加，相應(yīng)hepcidin基因表達(dá)也上調(diào)，但p-Smad1/5/8無明顯變化，川芎嗪可抑制p-

17、Stat3蛋白表達(dá)，hepcidin基因表達(dá)隨之下調(diào)，故推測高血脂狀態(tài)通過激活JAK/STAT途徑促進(jìn)了hepcidin的表達(dá)，而川芎嗪下調(diào)hepcidin的表達(dá)可能是通過抑制JAKs磷酸化STAT3（JAK/STAT途徑）來實(shí)現(xiàn)的。
　　結(jié)論:本研究結(jié)果提示高血脂可能通過引起血清hepcidin表達(dá)增多參與了高脂血癥繼發(fā)血管內(nèi)皮損傷的發(fā)生發(fā)展過程，通過觀察高血脂狀態(tài)下小鼠肝臟p-Stat3蛋白表達(dá)的變化，推測高血脂狀態(tài)是通過激活