基于水楊酸蓄積的實(shí)驗(yàn)小鼠糖尿病狀態(tài)下阿司匹林抵抗機(jī)制及川芎嗪干預(yù)研究.pdf

1、阿司匹林作為臨床常用的抗血小板藥物，在心腦血管的二級預(yù)防中發(fā)揮著重要作用。臨床上口服阿司匹林的部分患者仍然會發(fā)生血栓栓塞性事件，即存在“阿司匹林抵抗”(aspirin resistance，AR)現(xiàn)象。糖尿病已經(jīng)被證實(shí)是AR的危險(xiǎn)因素，但目前糖尿病相關(guān)的AR機(jī)制仍然不清楚。活血化瘀類中藥已被廣泛應(yīng)用于臨床抗血小板和抗凝治療，其活性成分已成為AR治療的替代藥物之一。
　　目的:
　　1.評估糖尿病狀態(tài)下阿司匹林的抗血小板作用在

2、性別上的差異;
　　2.揭示阿司匹林的主要代謝物SA與糖尿病狀態(tài)下AR具有潛在的聯(lián)系及可能的機(jī)制;
　　3.從內(nèi)源性物質(zhì)代謝變化角度探討了川芎嗪(TMP)干預(yù)糖尿病狀態(tài)下AR的代謝調(diào)控機(jī)制;
　　方法:
　　高脂飼料(HFD)結(jié)合鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)2型糖尿病(T2DM)病小鼠模型。正常飼料喂養(yǎng)小鼠隨機(jī)分為2組，每組14只（雌雄各7只），分別設(shè)正常組(Control)，正常+阿司匹林組(Control+Asp

3、); HFD/STZ誘導(dǎo)T2DM小鼠隨機(jī)分為5組分別為2型糖尿病模型組(T2DM)、2型糖尿病模型+阿司匹林組(T2DM+Asp)（雌雄各7只）;2型糖尿病+Asp組預(yù)給水楊酸(T2DM+SA+Asp)、2型糖尿病+Asp組預(yù)給碳酸氫鈉(T2DM+ NaHCO3+Asp)，T2DM+Asp組預(yù)先給予川芎嗪注射液(T2DM+ TMP+Asp);（雌鼠7只）;，Asp劑量13 mg/kg/day; SA劑量10 mg/kg/day; NaH

4、CO3劑量為600mg/kg/day; TMP劑量為100 mg/kg/day; SA和NaHCO3給藥方式為灌胃;TMP給藥方式為腹腔注射，均在阿司匹林給藥前，給藥周期同為10天。
　　小鼠血糖用一次性血糖儀檢測;血清胰島素、膽固醇、甘油三酯用酶法檢測;腎組織病理切片通過光學(xué)顯微鏡觀察;Elisa法檢測小鼠血清T IL-1β、 IL-6水平;采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測血小板CD62P(p-selectin)表達(dá);放免法檢測小鼠血漿TX

5、B>6-keto-PGF1α水平;HPLC檢測小鼠血漿SA水平;qPCR法測定小鼠主動脈COX-2及腎臟轉(zhuǎn)運(yùn)體(OATs、SMCTs、URAT1)mRNA水平;氣相色譜/質(zhì)譜(GC/MS)聯(lián)合多元統(tǒng)計(jì)分析用來確定TMP干預(yù)糖尿病狀態(tài)下AR小鼠血漿內(nèi)源性代謝物的變化。
　　結(jié)果:
　　1.T2DM雌性小鼠中出現(xiàn)明顯AR
　　HFD/STZ誘導(dǎo)的T2DM小鼠出現(xiàn)體重增加，高血糖和高脂血癥，雖然血漿胰島素水平輕度升高，提示有

6、胰島素抵抗。T2DM雌性小鼠血小板表面CD62P表達(dá)高于正常雌性小鼠，提示糖尿病狀態(tài)下可以增加雌性小鼠的血小板活性;正常組小鼠給予阿司匹林后，無論雌性還是雄性血小板表面CD62P表達(dá)均顯著下調(diào)而T2DM雌性小鼠給予阿司匹林后血小板表面CD62P表達(dá)與模型組比較無明顯改變，提示T2DM雌性小鼠給藥后血小板活性任然較高，出現(xiàn)了AR。T2DM雌性小鼠長期給予阿司匹林后TXB2/6-keto-PGF1α的比值不僅沒有降低，反而有增高的趨勢，這也

7、和之前血小板表面CD62P表達(dá)結(jié)果相一致。T2DM雌性小鼠給予阿司匹林后血小板表面CD62P表達(dá)及TXB2/6-keto-PGF1α水平均降低。
　　2.糖尿病狀態(tài)下腎臟相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體下調(diào)導(dǎo)致SA的蓄積，SA抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞代償性上調(diào)COX-2表達(dá)和活性
　　長期給予阿司匹林后，T2DM雌性組隨著阿司匹林給藥時間的增加，SA第1、5、10天谷濃度明顯增加，且在第10天SA各時間點(diǎn)的血藥濃度明顯升高，T2DM小鼠長期給予阿司匹林后

8、出現(xiàn)了SA蓄積，而T2DM雄性小鼠沒有出現(xiàn)SA蓄積現(xiàn)象。在預(yù)先給予SA的T2DM雌性小鼠較模型組出現(xiàn)了SA濃度及血小板表面CD62P表達(dá)、TXB2/6-keto-PGF1α水平升高，然而給予NaHCO3后逆轉(zhuǎn)了這一結(jié)果。且根據(jù)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)SA濃度和血漿TXB2/6-keto-PGF1α水平有相關(guān)性。我們進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)SA高濃度的T2DM雌性小鼠腹主動脈COX-2的mRNA和蛋白水平水平都顯著下調(diào)，且伴隨著 COX-2下游產(chǎn)物前列環(huán)素(

9、PGI2)的穩(wěn)定代謝物6-keto-PGF1α的降低，從而間接導(dǎo)致血漿中TXB2/6-keto-PGF1α水平升高，因此增加了T2DM雌性小鼠的血小板活性。我們發(fā)現(xiàn)T2DM雌性小鼠腎臟相關(guān)SA排泄依賴轉(zhuǎn)運(yùn)體如OAT1、OAT3、SMCT1、URAT1mRNA水平較正常組下調(diào)明顯，且出現(xiàn)腎小管空泡病變，該結(jié)果表面SA蓄積和腎臟轉(zhuǎn)運(yùn)體下調(diào)相關(guān)。
　　3.TMP對糖尿病狀態(tài)下AR的干預(yù)伴隨對相關(guān)代謝通路的調(diào)節(jié)
　　運(yùn)用代謝組學(xué)GC

10、/MS研究手段，結(jié)合之前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們從小鼠血漿中測定分析得出120個化合物，經(jīng)過數(shù)據(jù)庫鑒定得到79種代謝物。在PLS-DA的score-plot上可以發(fā)現(xiàn)，對照組和糖尿病模型組可以較好地區(qū)分，同時對照組和對照給藥組間的趨離程度明顯大于模型組和模型給藥組;與T2DM雌性小鼠中AR相關(guān)指標(biāo)較為一致。我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)模型狀態(tài)下顯著升高的代謝物質(zhì)有丙酮酸、三羥基丁酸、4-羥丁酸、花生四烯酸、葡萄糖、松二糖、膽固醇等，下降的物質(zhì)有乳酸、異亮氨酸

11、、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸。然而，TMP聯(lián)合阿司匹林可以逆轉(zhuǎn)上述部分異常代謝物水平，如花生四烯酸、葡萄糖、丙酮酸、膽固醇、尿酸和尿素，提示TMP可能通過改變花生四烯酸代謝，丙酮酸代謝，糖酵解，檸檬酸循環(huán)，色氨酸代謝通路從而干預(yù)糖尿病狀態(tài)下的AR。
　　結(jié)論:
　　本研究揭示了長期給予T2DM雌性小鼠阿司匹林后出現(xiàn)SA蓄積和AR。其可能機(jī)制是SA抑制了病理狀態(tài)下血管內(nèi)皮細(xì)胞COX-2表達(dá)和活性的代償性上調(diào)，打破了機(jī)體原有的COX