川芎嗪與丹參酚酸B聯(lián)合干預剪應力誘導血栓形成的研究.pdf

1、血栓形成導致的心、腦血管血栓性疾病已成為全球性的常見病和多發(fā)病，所引起的死亡約占人類非意外死亡原因的40％～50％。近年來，針對血栓形成的危險因素，如血小板粘附、聚集性增高，血液凝固性增強，纖溶活性減弱以及血液粘度增高方面的基礎和臨床研究有了很大進展。然而，血栓形成是一個動力學過程，強烈依賴局部血流和血管壁狀況。尤其動脈血栓的發(fā)生，絕大多數(shù)是在血管壁病變的基礎上，動脈狹窄或痙攣，異常的血流激活血小板，導致以血小板始動的血栓形成。參與血栓

2、形成的血小板—白細胞—內皮細胞受體—配體網(wǎng)絡聯(lián)結和粘附機制也日益成為抗血栓藥理及新藥研究的靶點。本項研究采用宏觀血液流變學、細胞血液流變學和分子血液流變學研究方法逐層深入，旨在探討剪應力誘導下血漿和全血粘度改變對血栓形成的影響，血小板、白細胞和內皮細胞三種細胞與血栓形成的關系，從細胞和分子水平揭示血栓形成過程中各要素隨剪應力大小和作用時間長短而改變的規(guī)律。在此基礎上，觀察活血化瘀中藥有效成分川芎嗪和丹參酚酸B對剪切誘導血栓形成的聯(lián)合干預

3、作用，尋求最佳組合劑量、優(yōu)勢作用靶點以及可能存在的協(xié)同效應。以期為血栓形成的基礎研究提供切實可行的思路與方法，也為臨床血栓性疾病的防治和抗血栓藥物的研制提供實驗依據(jù)。 上篇剪切誘導血栓形成規(guī)律和機制研究富血小板血漿(PRP)實驗：從血小板微血栓形成，剪切后血小板隨時間繼發(fā)聚集率變化，剪應力與聚集率相關性，剪應力與血漿粘度改變的關系，聚集率與血漿粘度的相關性方面揭示剪應力誘導血小板聚集、血漿粘度變化的規(guī)律。應用錐—板控應力流變儀、

4、熒光倒置顯微鏡、血小板聚集儀，采用比濁法和顯微鏡計數(shù)法，記錄血小板聚集和血漿粘度變化，SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析和相關分析。結果顯示，實驗過程無體外自發(fā)性血小板聚集發(fā)生；血小板血栓隨高剪應力作用后時間延長而增大；血小板受到15Pa和20Pa剪應力作用后4小時內，發(fā)生了明顯的繼發(fā)聚集，與剪切時間和剪應力呈正相關；血小板受到15Pa和20Pa剪應力作用后15分鐘內，用圖像分析軟件計算像素來表示聚集面積所得結果有非常顯著差異，

5、此結果和顯微鏡下計數(shù)方法計算15分鐘末的聚集率顯著相關，剪應力和聚集率呈正相關；高剪應力(15Pa以上)作用可以明顯升高PRP血漿粘度，低剪應力(1.8Pa)升高血漿粘度的作用不明顯，剪應力大小和血漿粘度變化之間沒有明顯相關性；PRP血漿粘度改變和血小板聚集率中度相關。結論：剪應力通過誘導血小板聚集、血漿粘度升高而引發(fā)微血栓形成，剪切PRP實驗中血小板聚集率增大是血漿粘度升高的主要原因。用15分鐘連續(xù)記錄，以面積評估血小板聚集程度，可以

6、應用于SIPA的測定。 全血實驗：進一步探討剪切誘導血小板發(fā)生聚集，血漿粘度升高，微血栓形成病理過程發(fā)生的細胞、分子機制，和剪切強度(包括剪應力和剪切時間的組合)相關性；明確血小板、白細胞自身活化以及相互間粘附聚集在血栓形成中的作用。運用雙因素3×3水平析因設計設立剪切強度進行實驗；應用錐—板控應力流變儀、熒光倒置顯微鏡、流式細胞儀、紫外可見光分光光度計；采用全血法流式細胞術、顯微鏡計數(shù)法和紫外分光光度法；SPSS13.0統(tǒng)計軟

7、件進行單因素方差ANOVA分析和相關分析，STATISTICA統(tǒng)計軟件多因素方差MANOVA分析協(xié)同作用，三維曲面擬合方法得出二元二次曲面描述因素間非線性關系。結果首先明確了最高剪切強度20Pa250s約使千分之一的紅細胞發(fā)生溶血，不足以影響剪切誘導全血血小板聚集的實驗結果；鏡下觀察到隨剪應力升高而增大的血小板血栓；剪切誘導全血血小板聚集和剪應力水平、剪切時間相關，但兩者的協(xié)同作用不明顯；剪應力大小與血液粘度(升高—降低—升高)變化轉折

8、時間點呈顯著負相關，高剪應力時粘度上升率和剪應力大小呈正相關，以此建立一種可以定量剪應力誘導全血粘度變化的指標；剪應力誘導血小板活化、血小板白細胞粘附實驗觀察四個剪切強度5Pa5s、5Pa250s、20Pa5s和20Pa250s。5Pa5s條件下，血小板GPⅠb/Ⅴ/Ⅸ和白細胞CD11b已有表達。剪切強度達到5Pa250s時，血小板聚集明顯增強，PLA形成、PMPs釋放和血小板P-Selectin表達也明顯增多。血小板GPⅡb/Ⅲa表達

9、在剪應力增大、剪切時間延長到一定程度才很顯著。 大鼠腦微血管內皮細胞實驗：探討剪應力作用后微血管內皮細胞PS異位發(fā)生、粘附分子表達的規(guī)律，以及對內皮損傷進而血栓形成的影響。采用流式細胞術、熒光相差倒置顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、HAAKERS600控應力流變儀板—板和錐—板剪切裝置、免疫熒光染色法和細胞培養(yǎng)等技術和設備；SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差ANOVA分析。成功培養(yǎng)大鼠腦微血管內皮細胞細胞，熒光免疫組織化學鑒定合格

10、；用生理范圍的剪應力1.5Pa和高剪應力3Pa作用于微血管內皮細胞都有PS異位；1.5Pa組的PS異位率8.38％小于靜態(tài)培養(yǎng)細胞的異位率；高剪應力3Pa作用組PS異位率為24.23％，顯著高于1.5Pa組，而且，與1.5Pa組相比，3Pa組的Annexin-V-FITC+/PI+比率顯著增大；與3Pa450s相比，3Pa900s組有大量PI+細胞；與低剪應力1.5Pa相比，高剪應力3Pa作用后微血管內皮細胞ICAM-1表達顯著地增強，

11、未得出微血管內皮細胞VCAM-1表達的結果。結論：高剪應力誘導微血管內皮細胞PS異位發(fā)生，3PaPS異位率為24.23％，3Pa剪應力引起明顯細胞膜破損，已經造成了內皮損傷，隨時間延長損傷更嚴重。高剪應力誘導微血管內皮細胞ICAM-1表達增強，無VCAM-1表達。 由此可見，剪應力通過對血小板、白細胞、內皮細胞膜糖蛋白、粘附分子的表達、細胞間粘附聚集及宏觀血液流變性等多種因素的影響而誘導血栓形成。本研究表明，在血栓形成與剪切強度

12、之間有顯著相關性。 下篇川芎嗪與丹參酚酸B對剪切誘導血栓形成聯(lián)合干預作用的機理研究探討了川芎嗪和丹酚酸B分別與聯(lián)合應用對于血小板、腦微血管內皮細胞、白細胞以及宏觀血液流變性的影響，以及兩者聯(lián)合應用抑制剪切誘導的血栓形成的有效比例與協(xié)同效應。采用雙因素3×3水平析因設計，川芎嗪和丹參酚酸B為雙因素，各選三個濃度(0，小劑量，大劑量)為三水平；SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差ANOVA分析及析因方差分析，STATISTICA統(tǒng)

13、計軟件多因素方差MANOVA分析協(xié)同作用，三維曲面擬合方法得出二元二次曲面描述因素間非線性關系。結果顯示：(1)丹參酚酸B和川芎嗪可以改善血漿粘度，有降低全血血液粘度上升率的趨勢，還可降低PRP血小板聚集率以及全血血小板聚集率，最佳劑量組合是丹參酚酸B20μM和川芎嗪0.37mM。此組合可以通過抗血小板膜糖蛋白分子表達、抗白細胞粘附分子表達、減少PMPs釋放來發(fā)揮抑制血小板聚集，血小板和白細胞粘附，進而抗血栓形成的作用。川芎嗪0.73m

14、M的高劑量對血漿粘度有不良反應的趨勢。丹參酚酸B對血小板聚集顯示出突出的抑制作用，但PRP實驗中高劑量顯著而全血實驗中低劑量作用更強。(2)川芎嗪和丹參酚酸B可以改善諸多因素引起的內皮損傷、粘附分子表達，川芎嗪對內皮細胞的作用更有優(yōu)勢，川芎嗪高劑量(0.73mM)聯(lián)用低劑量的丹參酚酸B(10μM)有非常顯著的協(xié)同作用。 總結綜上所述，本研究結合血液流變學、細胞培養(yǎng)和流式細胞術等技術，運用多種統(tǒng)計分析方法，揭示血漿和血液粘度，細胞