溫?zé)釋?duì)HPV感染細(xì)胞中APOBEC3的影響及機(jī)制探討.pdf

1、目的：
　　本實(shí)驗(yàn)擬回答如下問(wèn)題:APOBEC3在良性增生性皮損、癌前病變、原位癌及皮膚腫瘤中表達(dá)是否存在差異？IFN是公認(rèn)的誘導(dǎo)內(nèi)源性APOBEC表達(dá)增加的原因之一。那么溫?zé)嵩谥委烪PV感染性疾病中是否會(huì)促進(jìn)APOBEC表達(dá)增加，以及APOBEC是否通過(guò)脫氨酶機(jī)制發(fā)揮抗病毒作用？為解決上述問(wèn)題，本實(shí)驗(yàn)首先利用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)APOBEC3A和3G在尖銳濕疣、鮑溫病、鮑溫樣丘疹病、日光性角化病、鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)，其次采用

2、Real-time PCR和3D-PCR技術(shù)檢測(cè)尖銳濕疣和宮頸癌細(xì)胞系經(jīng)體內(nèi)、體外溫?zé)岷驛POBEC3A和3G的表達(dá)以及對(duì)HPV的編輯作用，最后采用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建過(guò)表達(dá)APOBEC3A的宮頸癌細(xì)胞系，觀察APOBEC3A的生物學(xué)功能并探討可能的分子機(jī)制，為研究溫?zé)嶂委烪PV感染性疾病提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　一、實(shí)驗(yàn)對(duì)象
　　石蠟組織切片標(biāo)本來(lái)自于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚科2008～2013年存檔的，經(jīng)病

3、理組織學(xué)結(jié)果證實(shí)為尖銳濕疣、鮑溫病、鮑溫樣丘疹病、日光性角化病和鱗狀細(xì)胞癌的組織。體內(nèi)及體外溫?zé)峤M織標(biāo)本來(lái)自于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚科門診診斷為尖銳濕疣患者的組織，符合2014年衛(wèi)生部防疫司制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)?；颊呋蚱浔O(jiān)護(hù)人知情同意，獲得中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)批準(zhǔn)，并符合赫爾辛基宣言。細(xì)胞系選擇為表達(dá)不同HPV拷貝數(shù)的宮頸癌細(xì)胞系(CaSki、SiHa、C33A)作為研究對(duì)象。
　　二、溫?zé)嶂委煼桨?br>　　采

4、用自主研制的溫?zé)嶂委焹x（專利號(hào)ZL200720185403.3，中國(guó)醫(yī)科大學(xué)），給予非接觸式的定點(diǎn)加熱方法，通過(guò)紅外體溫檢測(cè)儀反饋溫度，使其保持在指定的溫度范圍內(nèi)。
　　體內(nèi)溫?zé)?選取靶疣（較大疣體或解剖部位方便照射的疣體）進(jìn)行局部44℃溫?zé)嶂委?，連續(xù)治療3天，每天1次，每次30分鐘。間隔7-10天，再連續(xù)治療2天，每天1次，每次30分鐘。后每間隔7天進(jìn)行1次治療，直至疣體消退。3個(gè)月時(shí)觀察臨床療效。
　　體外溫?zé)?將尖銳濕

5、疣組織一式三份，真皮側(cè)浸潤(rùn)至培養(yǎng)基內(nèi)，表皮側(cè)暴露于空氣中，分別給予37℃、42℃和45℃溫?zé)?0分鐘，常規(guī)培養(yǎng)12小時(shí)。
　　細(xì)胞溫?zé)?采用水浴鍋加熱方式，方法同體外溫?zé)帷?br>　　三、免疫組化檢測(cè)相關(guān)蛋白
　　石蠟切片4μm，用免疫組化染色技術(shù)(SP法)檢測(cè)APOBEC3A和3G表達(dá)。石蠟組織切片經(jīng)脫蠟、抗原修復(fù)、一抗、二抗、顯色、復(fù)染并拍照，在20倍物鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，利用Image-pro Plus軟件分析平均光

6、密度值。
　　四、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)APOBEC3A和3G mRNA的表達(dá)
　　采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)APOBEC3A和3G mRNA的表達(dá)。按Qiagen提取試劑說(shuō)明書提取總RNA;用PrimeScript RT regagent Kit(Takara)試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA; SYBR Premis Ex Taq(Takara)試劑盒行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，采用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法行相對(duì)定量結(jié)果分析。
　　

7、五、Western blot檢測(cè)APOBEC3A和3G蛋白的表達(dá)
　　采用Western blot方法檢測(cè)溫?zé)崆昂驛POBEC3A和3G蛋白表達(dá)水平的變化。按照蛋白提取法提取細(xì)胞中蛋白;BCA檢測(cè)蛋白濃度;經(jīng)制膠、跑膠、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗、二抗、ECL顯色并拍照，觀察蛋白表達(dá)變化。
　　六、3D-PCR擴(kuò)增HPV E2基因時(shí)變性溫度的變化
　　利用3D-PCR方法檢測(cè)HPV E2基因擴(kuò)增時(shí)的變性溫度。按Qiagen提取試

8、劑說(shuō)明書提取總DNA;用GoTaq Colorless Master Mix(Promega)試劑盒擴(kuò)增HPV E2基因，通過(guò)改變變性溫度觀察PCR擴(kuò)增情況，推測(cè)是否存在G-A和C-T的突變。
　　七、MTS檢測(cè)APOBEC3 A對(duì)細(xì)胞增殖的影響
　　利用MTS方法檢測(cè)APOBEC3A對(duì)細(xì)胞增殖的作用。將轉(zhuǎn)染APOBEC3A基因組和空白對(duì)照組細(xì)胞接種于96孔板中，分別于第0天、1天、2天、3天和4天進(jìn)行檢測(cè)，490nm處觀察

9、吸光度值。
　　八、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)APOBEC3A對(duì)細(xì)胞周期和凋亡的影響
　　利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)APOBEC3A對(duì)細(xì)胞周期和凋亡的影響。將轉(zhuǎn)染APOBEC3A基因組和空白對(duì)照組細(xì)胞接種于六孔板中，用FITC AnnexinⅤ凋亡試劑盒和PI試劑分別檢測(cè)細(xì)胞凋亡的變化和周期的分布。
　　九、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用GraphPad Prim軟件對(duì)資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。僅有兩組數(shù)據(jù)時(shí)測(cè)得結(jié)果采用(x)±S表示，比較采用unpaired

10、 t test或Mann-Whitney test。超過(guò)兩組數(shù)據(jù)時(shí)比較采用方差分析。P＜0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)果：
　　1、APOBEC3A和3G在皮膚腫瘤性疾病中的表達(dá)
　　利用免疫組織化學(xué)方法觀察APOBEC3A和3G在各組織中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，APOBEC3A在正常皮膚中呈陽(yáng)性表達(dá)，APOBEC3G則呈陰性或弱陽(yáng)性表達(dá)，而兩者在腫瘤性疾病中表達(dá)量均明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

11、r>　　2、溫?zé)釋?duì)HPV感染組織和細(xì)胞中APOBEC3A和3G表達(dá)的影響
　　三種含有HPV16不同拷貝數(shù)的宮頸癌細(xì)胞系，經(jīng)37℃、42℃和45℃處理后，細(xì)胞中的APOBEC3A和3G表達(dá)水平增高，且呈溫度依賴性。同時(shí)，除與溫度呈正相關(guān)外，與細(xì)胞中病毒拷貝數(shù)也密切相關(guān)。病毒拷貝數(shù)越高，細(xì)胞對(duì)溫?zé)崽幚碓矫舾?，APOBEC3A和3G增高的水平也越顯著。而不含HPV的C33A細(xì)胞溫?zé)崽幚砬昂驛POBEC3A和3G表達(dá)水平無(wú)明顯變化。尖銳

12、濕疣患者皮損體外溫?zé)岷驛POBEC3A和3G變化水平同上。
　　3、溫熟對(duì)宮頸癌細(xì)胞中HPVE2基因的影響
　　首先采用3D-PCR技術(shù)觀察溫?zé)崽幚砬昂螅琀PVE2基因擴(kuò)增時(shí)變性溫度的變化，推測(cè)病毒序列是否發(fā)生突變。結(jié)果顯示，44℃溫?zé)岷蟮腃aSki細(xì)胞HPVE2基因經(jīng)PCR擴(kuò)增時(shí)變性溫度從85.5℃降低到83.7℃，而SiHa細(xì)胞溫?zé)崽幚砗驪CR擴(kuò)增的變性溫度則從85.5℃降低到84.1℃。DNA測(cè)序結(jié)果明確基因突變個(gè)數(shù)，

13、結(jié)果為溫?zé)岷驝aSki細(xì)胞共產(chǎn)生12個(gè)G-A和18個(gè)C-T的突變，SiHa細(xì)胞共產(chǎn)生9個(gè)G-A和12個(gè)C-T的突變，推測(cè)溫?zé)岷笳T導(dǎo)的APOBEC3A和3G水平的增加很可能是E2基因發(fā)生突變的重要原因。
　　4、溫?zé)嶂委煂?duì)尖銳濕疣患者皮損中APOBEC3A和3G的影響
　　共有6例多發(fā)性尖銳濕疣患者接受溫?zé)嶂委?，分別于治療前、治療2周、6周行活組織檢查。其中4例患者在治療第6周時(shí)部分皮損出現(xiàn)消退，1例患者于治療第4周時(shí)皮損完全

14、消退，1例患者治療3個(gè)月無(wú)效后采取手術(shù)治療。
　　(1)、溫?zé)嶂委熐昂驛POBEC3A和3G mRNA的表達(dá)
　　溫?zé)嶂委熀箴囿w局部APOBEC3A和3G mRNA表達(dá)量升高，且隨著治療時(shí)間延長(zhǎng)，增加更為明顯。但療效較差的1例患者，治療前后APOBEC3A和3G表達(dá)水平未見(jiàn)明顯變化。
　　(2)、溫?zé)嶂委熐昂驢PVE2基因突變個(gè)數(shù)
　　溫?zé)嶂委熀箴囿w局部HPV E2基因擴(kuò)增時(shí)變性溫度降低，且隨著治療周期延長(zhǎng)，變性

15、溫度進(jìn)一步降低。DNA測(cè)序結(jié)果顯示，溫?zé)岷蟮酿囿w中含有更多的G-A和C-T的突變，尤其在治療效果較好的患者中，突變個(gè)數(shù)顯著增高，而治療效果欠佳的患者未見(jiàn)明顯E2基因突變。
　　5、APOBEC3A對(duì)宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響
　　(1)、建立過(guò)表達(dá)APOBEC3A的宮頸癌細(xì)胞系，結(jié)果顯示APOBEC3A可以抑制宮頸癌細(xì)胞生長(zhǎng)，尤其在含有高病毒拷貝數(shù)的CaSki細(xì)胞中，抑制作用從第3天持續(xù)至第4天。同時(shí)流式細(xì)胞結(jié)果發(fā)現(xiàn)在CaS

16、ki細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染APOBEC3A基因后，G1期細(xì)胞比例從53.92％增長(zhǎng)到60.31％，S期細(xì)胞比例則從30.85％降至25.82％。SiHa細(xì)胞未見(jiàn)明顯變化。此外，轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞凋亡水平均未見(jiàn)明顯變化。
　　(2)、過(guò)表達(dá)APOBEC3A基因的CaSki細(xì)胞和SiHa細(xì)胞，與對(duì)照組相比，E2基因擴(kuò)增時(shí)變性溫度明顯降低，分別從85.2℃下降到84.6℃和85.5℃下降到84℃，同時(shí)過(guò)表達(dá)APOBEC3A的細(xì)胞中，HPVE2基因的G-

17、A和C-T的突變頻率明顯增加。
　　結(jié)論：
　　1、APOBEC3A和3G的表達(dá)可能與皮膚腫瘤性疾病的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)，具有重要的臨床與科研價(jià)值。
　　2、溫?zé)峥商岣逪PV感染細(xì)胞中APOBEC3A和3G的表達(dá)，且呈溫度依賴性，并與病毒拷貝數(shù)密切相關(guān)。
　　3、溫?zé)崽幚砗驢PVE2基因中G-A和C-T的突變頻率增加，這很可能是溫?zé)嶂委烪PV相關(guān)疾病另一重要機(jī)制，為臨床治療提供新的靶點(diǎn)。
　　4、尖銳