HPV38 E6-E7對角質(zhì)形成細(xì)胞自噬的影響及機制探討.pdf

1、人乳頭瘤病毒(human papillomavirus,HPV)是一類嗜上皮組織的雙鏈閉合小DNA病毒,目前已發(fā)現(xiàn)一百余種亞型。HPV感染可引起人類的多種良、惡性疾病,現(xiàn)已證明持續(xù)感染高危型α-HPV可引起宮頸癌,大量臨床資料和研究表明β-HPV感染與非黑素瘤性皮膚腫瘤(nonmelanoma skin cancer,NMSC)的發(fā)病密切相關(guān)。盡管與黑素瘤相比,NMSC很少發(fā)生轉(zhuǎn)移,致死率低,但近年來在全球范圍內(nèi)NMSC發(fā)病率逐年上升,

2、給社會造成了巨大的醫(yī)療負(fù)擔(dān),因其多發(fā)生在顏面等光暴露部位也給患者帶來了沉重的身心壓力。因此,對其發(fā)病機制的研究備受科學(xué)家的關(guān)注,研究者發(fā)現(xiàn)NMSC發(fā)病除了與紫外線(ultraviolet ray,UV)照射、人種、年齡、地域、免疫抑制等因素相關(guān)外,還與β-HPV感染關(guān)系密切。
　　細(xì)胞自噬是一種普遍存在于真核細(xì)胞中的保護性機制。細(xì)胞自噬通過形成自噬溶酶體來清除失去功能、變性和受損的細(xì)胞器、大分子物質(zhì)和蛋白質(zhì)等,與人類的多種疾病發(fā)生

3、密切相關(guān)如衰老、神經(jīng)退行性變、惡性腫瘤、病原微生物感染等。細(xì)胞自噬和腫瘤關(guān)系目前還存在很大的爭議,這可能與自噬具有抑制和促進腫瘤的雙重作用相關(guān)。自噬在腫瘤的發(fā)生階段,可以防止細(xì)胞惡變,發(fā)揮抑制腫瘤作用;在腫瘤形成階段,自噬又能為腫瘤提供能量,增強腫瘤細(xì)胞的生存能力。研究認(rèn)為自噬在抗病毒的活動中具有雙面性,一方面,當(dāng)病毒入侵機體時,自噬通過協(xié)助固有免疫及適應(yīng)性免疫,抵抗病毒感染;另一方面,細(xì)胞自噬又被某些病毒所利用,為病毒復(fù)制、轉(zhuǎn)錄提供場

4、所和能量,有利于病毒持續(xù)感染。
　　目前,β-HPV確切的致病機理及有無致病的高危亞型仍不清楚,有關(guān)β-HPV與細(xì)胞自噬在NMSC發(fā)病中的作用未見報道。為此,本課題組前期的研究內(nèi)容之一是了解我國與NMSC發(fā)生密切相關(guān)的高危β-HPV亞型,并探索β-HPV在NMSC發(fā)病中的分子機制。結(jié)果表明:HPV38是與光線性角化病(actinic keratosis,AK)和鱗狀細(xì)胞癌(squamous cell carcinoma,SCC)發(fā)

5、病最為密切的亞型;利用透射電鏡觀察和免疫組化的方法發(fā)現(xiàn),HPV38陽性的SCC組織中細(xì)胞自噬水平明顯增高,提示細(xì)胞自噬可能在 NMSC發(fā)病中起著重要的作用,HPV38可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬發(fā)揮其致癌作用,那么在細(xì)胞水平上,HPV38對細(xì)胞自噬的影響是什么?其作用的分子機制又是什么?這些都是尚需研究的問題。
　　方法：
　　本研究以人永生化HaCaT細(xì)胞為研究對象,首先建立HPV38 E6/E7過表達的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株,為研究構(gòu)建

6、細(xì)胞模型;其次利用CCK-8、平板克隆形成實驗、流式細(xì)胞術(shù)檢測HPV38 E6/E7對細(xì)胞生物學(xué)功能的影響,及Western blot法、透射電鏡觀察細(xì)胞自噬水平,并檢測自噬對細(xì)胞增殖、凋亡的影響;最后,探討HPV38 E6/E7誘導(dǎo)細(xì)胞自噬發(fā)生的分子機制。
　　主要結(jié)果：
　　1.HPV38 E6/E7質(zhì)粒經(jīng)轉(zhuǎn)化、擴增、抽提后,以及XbaⅠ/Bam HI雙酶切鑒定,結(jié)果顯示所購質(zhì)粒確實含有HPV38 E6/E7目的片段,利

7、用脂質(zhì)體法成功將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入人永生化 HaCaT細(xì)胞,并構(gòu)建穩(wěn)定表達 HaCaT-pGCMV細(xì)胞和HaCaT-HPV38 E6/E7細(xì)胞株;
　　2.CCK-8和平板克隆形成實驗結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染HPV38 E6/E7后細(xì)胞增殖活力明顯升高;采用Annexin V/PI法檢測細(xì)胞凋亡,重復(fù)多次發(fā)現(xiàn):HaCaT-pGCMV細(xì)胞凋亡率水平高于HaCaT-HPV38 E6/E7細(xì)胞,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞計數(shù)檢測細(xì)

8、胞周期發(fā)現(xiàn):HaCaT-HPV38 E6/E7細(xì)胞S期細(xì)胞比例高于HaCaT-pGCMV細(xì)胞,結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05);
　　3.Western blot法檢測細(xì)胞自噬特異性蛋白表達水平,結(jié)果顯示:與HaCaT-pGCMV細(xì)胞相比,HaCaT-HPV38 E6/E7細(xì)胞Beclin1、LC3表達水平明顯升高,p62表達則下降,同樣利用透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn):HaCaT-HPV38E6/E7細(xì)胞中自噬小體的數(shù)目明顯高于HaCaT

9、-pGCMV細(xì)胞(P<0.05);
　　4.Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn):加入細(xì)胞自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)后,HaCaT-HPV38 E6/E7細(xì)胞自噬活力明顯下降;CCK-8檢測顯示:加入3-MA后,HaCaT-HPV38 E6/E7細(xì)胞增殖受到抑制,與對照組相比未見明顯差異(P>0.05)。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果發(fā)現(xiàn):與對照組細(xì)胞相比,HPV38 E6/E7可以降低細(xì)胞凋亡,抑制該細(xì)胞自噬后,則細(xì)胞凋亡明顯

10、升高,結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);
　　5.Westerm blot法檢測結(jié)果顯示:與HaCaT-pGCMV細(xì)胞相比,HaCaT-HPV38 E6/E7細(xì)胞中p-PKRThr451、p-eIF2αSer51蛋白表達水平明顯升高;加入PKR磷酸化抑制劑2-氨基嘌呤(2-AP)后,同樣采用Westerm blot法檢測發(fā)現(xiàn),2-AP成功抑制了PKR磷酸化后,p-eIF2αSer51水平隨之降低,自噬特異標(biāo)記蛋白Beclin1、

11、LC3表達水平明顯下降,2-AP濃度為5 mmol/L時作用更明顯。
　　主要結(jié)論：
　　1.HPV38 E6/E7改變細(xì)胞周期,使S期細(xì)胞數(shù)增多,引起細(xì)胞明顯增殖,克隆形成能力增強,并且能夠顯著抑制細(xì)胞凋亡發(fā)生;
　　2.HPV38 E6/E7能夠引起細(xì)胞自噬水平明顯增高,為快速增殖提供能量和原料,這可能是其生物學(xué)功能之一,相反抑制細(xì)胞自噬水平則會引起細(xì)胞增殖減少,細(xì)胞凋亡增加,提示HPV38 E6/E7可能通過細(xì)胞