雌激素對角質(zhì)形成細胞增殖的影響及其機制研究.pdf

1、目的：
　　創(chuàng)面愈合是燒傷救治的關(guān)鍵問題，為了縮短創(chuàng)面的自然愈合時間，改善創(chuàng)面的愈合質(zhì)量，除現(xiàn)有的藥物治療和外科手術(shù)等修復(fù)創(chuàng)面方法外，尋找更好的治療藥物或其他手段以達到創(chuàng)面的高質(zhì)量愈合，一直都是臨床醫(yī)師特別是燒傷科醫(yī)師的追求目標和科研攻關(guān)方向。本研究主要目的是通過觀察雌激素缺乏時對小鼠表皮發(fā)育和創(chuàng)面愈合的影響和雌激素對人永生化角質(zhì)形成細胞系(HaCaT)增殖的影響，從而探索雌激素促進角質(zhì)形成細胞增殖的分子機制。
　　方法：<

2、br>　　(1)將通過陰道脫落細胞學(xué)檢查法選取的5只處于動情期的C57BL/6成年（8周齡大?。┬∈笤O(shè)為動情期組，將5只性發(fā)育前（4周齡大?。┬新殉睬谐某赡辏?周齡大小）C57BL/6小鼠設(shè)為卵巢切除組。取2組小鼠尾根部1 cm寬的全層皮膚，免疫組織化學(xué)法觀察表皮增殖細胞核抗原(PCNA)陽性細胞分布并計數(shù)，HE染色觀察并測量表皮厚度。
　　(2)將通過陰道脫落細胞學(xué)檢查法選取的5只處于動情期的C57BL/6成年（8周齡大?。┬?/p>

3、鼠設(shè)為動情期組，將5只性發(fā)育前（4周齡大?。┬新殉睬谐腃57BL/6成年（8周齡大?。┬∈笤O(shè)為卵巢切除組。在2組小鼠背部脊柱兩側(cè)制作長度為1 cm的全層皮膚切口，并在傷后的0、1、3、5、7天拍照觀測創(chuàng)面愈合率，然后在傷后第7天取小鼠創(chuàng)周皮膚組織，通過HE染色觀測2組小鼠創(chuàng)面新生上皮長度。
　　(3)通過陰道脫落細胞學(xué)檢查法將16只C57BL/6成年（8周齡大?。┬∈蠓譃閯忧榍捌诮M、動情期組、動情后期組、動情間期組，每組4只。將

4、4只性發(fā)育前(4周齡大小)行卵巢切除的成年（8周齡大?。〤57BL/6小鼠設(shè)為卵巢切除組。采集5組小鼠腹部正常皮膚組織，用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測p-ERK、p-Akt、PCNA蛋白表達水平。
　　(4)取處于對數(shù)生長期HaCaT細胞，用含體積分數(shù)10％FBS的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)（下同），按隨機數(shù)字表法分為陰性對照組、單純雌二醇組、蛋白激酶B(Akt)抑制劑組、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)抑制劑組，每組含25個孔。各組培養(yǎng)液中

5、，陰性對照組加入1μ L二甲基亞砜;單純雌二醇組加入100 nmol/L17β-雌二醇1μL;Akt抑制劑組和ERK抑制劑組均加入同前劑量與體積17β-雌二醇，另分別加入10μmol/L LY294002和30μmol/L PD98059各1μL。分別于培養(yǎng)0（且口刻）、24、48、72、96 h，每組取5孔細胞，用細胞計數(shù)試劑盒與酶標儀檢測細胞增殖水平（結(jié)果以吸光度值表示）。
　　(5)另取處于對數(shù)生長期HaCaT細胞，同前(4

6、)實驗分組和處理細胞，每組含3個孔。培養(yǎng)72 h，用流式細胞術(shù)檢測細胞周期分布，并以此按公式計算出各組細胞的增殖指數(shù)(PI)和S期比例(SPF)。
　　(6)另取處于對數(shù)生長期HaCaT細胞，按雌激素（17β-雌二醇）處理時間不同分為7個組，即0min組（未經(jīng)雌激素處理）、5min組、15min組、30min組、60min組、120min組、240min組。在相應(yīng)培養(yǎng)時間收集各組細胞并提取蛋白，然后用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測各組細胞磷

7、酸化ERK(p-ERK)、磷酸化Akt(p-Akt)和增殖細胞核抗原(PCNA)蛋白水平。
　　(7)另取處于對數(shù)生長期HaCaT細胞，同前(4)實驗分組和處理細胞，每組含3個孔。培養(yǎng)72 h，收集各組細胞并提取蛋白，然后用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測各組細胞磷酸化ERK(p-ERK)、磷酸化Akt(p-Akt)和增殖細胞核抗原(PCNA)蛋白水平。
　　(8)另取處于對數(shù)生長期HaCaT細胞，同前(4)實驗分組和處理細胞，每組含3

8、個孔。培養(yǎng)72 h，收集各組細胞并提取總RNA，然后用實時熒光定量PCR法檢測各組細胞糖原合成激酶3β(Gsk-3β)基因和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)基因的表達水平。
　　(9)統(tǒng)計分析:對數(shù)據(jù)行t檢驗、單因素方差分析、析因設(shè)計方差分析、LSD檢驗。
　　結(jié)果：
　　(1)2組小鼠表皮PCNA陽性細胞主要集中于表皮基底層;卵巢切除組小鼠表皮中PCNA陽性細胞數(shù)為(37±12)個，明顯少于動情期組的(96±15)

9、個。卵巢切除組小鼠表皮厚度為(33.5±3.0)μ m，明顯低于動情期組的(51.4±3.1)μ m。
　　(2)在傷后第5天，與動情期組小鼠創(chuàng)面愈合率(59.0±2.2)％相比，卵巢切除組小鼠創(chuàng)面愈合率(49.9±2.1)％降低(P＜0.05)，在傷后第7天，與動情期組小鼠創(chuàng)面愈合率(85.5±3.0)％相比，卵巢切除組小鼠創(chuàng)面愈合率為(73.0±0.9)％，愈合顯著延遲(P＜0.01)。
　　(3)不同動情周期的小鼠和卵

10、巢切除小鼠正常皮膚中，p-Akt、p-ERK以及PCNA表達水平不一致。動情前期和動情期小鼠皮膚中p-ERK、p-Akt、PCNA蛋白的表達水平要高于動情后期、動情間期和卵巢切除組小鼠。
　　(4)培養(yǎng)0～48 h，單純雌二醇組與陰性對照組細胞增殖水平差異不明顯。培養(yǎng)72 h，與陰性對照組的0.983±0.060比較，單純雌二醇組細胞增殖水平明顯增高;Akt抑制劑組、ERK抑制劑組細胞增殖水平分別為0.325±0.031、0.35

11、9±0.063，均明顯低于前2組。培養(yǎng)96 h，單純雌二醇組細胞增殖水平為1.888±0.022，仍高于陰性對照組的0.669±0.032，而Akt抑制劑組和ERK抑制劑組增殖水平分別為0.367±0.019、0.474±0.011，均低于陰性對照組和單純雌二醇組。
　　(5)培養(yǎng)72 h，與陰性對照組的PI(51.6±1.1)％比較，單純雌二醇組細胞PI明顯升高[(58.5±0.8)％，P＜0.05];Akt抑制劑組、ERK抑制

12、劑組細胞PI分別為(34.9±0.8)％、(48.2±0.4)％，均明顯低于前2組。與陰性對照組的SPF(31.7±1.2)％比較，單純雌二醇組細胞SPF明顯升高[(40.2±0.5)％，P＜0.01];Akt抑制劑組SPF為(15.7±0.7)％，明顯低于前兩組（P值均小于0.01），ERK抑制劑組SPF為(33.0±0.1)％，與陰性對照組差異不明顯(P＞0.05)，但仍低于單純雌二醇組(P＜0.01)。
　　(6)培養(yǎng)5 m

13、in后，p-ERK即開始顯著的升高，5、15、30 min組細胞p-ERK表達水平分別為3.306±0.042、1.847±0.053、0.545±0.053，與0 min組細胞p-ERK表達水平0.037±0.017）相比，均有顯著性升高，但隨后又逐漸下降，即0min組細胞與60 min、120 min、240 min組細胞差異不明顯。培養(yǎng)15 min后，與0 min組細胞p-Akt表達水平0.100±0.007相比，15、30、60

14、、120min組細胞p-Akt表達水平分別是0.153±0.007、0.188±0.009、0.201±0.007、0.220±0.006，均有顯著性升高，但240 min組細胞p-Akt表達水平與0min組細胞相比差異不明顯。與0min組細胞相比，在17β-雌二醇處理HaCaT細胞240 min內(nèi)，PCNA表達水平一直無明顯變化。
　　(7)培養(yǎng)72 h，與陰性對照組的0.566±0.034比較，單純雌二醇組細胞p-Akt蛋白水

15、平明顯升高;Akt抑制劑組和ERK抑制劑組細胞p-Akt蛋白水平分別為0.682±0.095、0.672±0.019，顯著低于單純雌二醇組。培養(yǎng)72 h，與陰性對照組的0.469±0.013比較，單純雌二醇組、Akt抑制劑組、ERK抑制劑組細胞p-ERK蛋白水平均明顯升高。與單純雌二醇組比較，ERK抑制劑組細胞p-ERK蛋白水平明顯降低(P＜0.01)。培養(yǎng)72 h，與陰性對照組的0.386±0.053比較，單純雌二醇組細胞PCNA蛋白

16、水平明顯升高(0.743±0.043，P＜0.01);Akt抑制劑組和ERK抑制劑組細胞PCNA蛋白水平分別為0.264±0.019、0.223±0.065，明顯低于前2組(P值均小于0.01)。
　　(8)培養(yǎng)72 h，與陰性對照組細胞mTOR基因表達水平(1.003±0.058)相比，單純雌二醇組細胞mTOR基因表達水平明顯升高(1.803±0.292，P＜0.05)，而Akt抑制劑組細胞(1.255±0.081)和ERK抑制

17、劑組細胞(0.987±0.042) mTOR基因表達水平升高不明顯(P＞0.05)。與單純雌二醇組相比，Akt抑制劑組與之差異不明顯(P＞0.05)，ERK抑制劑組mTOR基因表達水平明顯降低(P＜0.05)。與陰性對照組細胞Gsk-3β基因表達水平(1.015±0.124)相比，單純雌二醇組細胞Gsk-3β基因表達水平明顯降低(0.043±0.003，P＜0.01)，而Akt抑制劑組細胞(0.526±0.0042)和ERK抑制劑組細胞

18、(0.276±0.040) Gsk-3β基因表達水平也明顯降低（P值均小于0.01）。與單純雌二醇組相比，ERK抑制劑組與之差異不明顯(P＞0.05)，Akt抑制劑組Gsk-3β基因表達水平明顯升高(P＜0.01)。
　　結(jié)論：
　　雌激素缺乏時，小鼠表皮增殖發(fā)育能力減弱，創(chuàng)面愈合速率減慢。雌激素可通過ERK/Akt信號通路介導(dǎo)下游PCNA的表達從而調(diào)控角質(zhì)形成細胞的增殖，從增殖角度為雌激素促進皮膚創(chuàng)面再上皮化、加快創(chuàng)面愈合