微電流影響角質(zhì)形成細(xì)胞增殖反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、臨床工作中，應(yīng)用電刺激治療難愈性創(chuàng)面，多以電流強(qiáng)度為主要調(diào)節(jié)參數(shù)。臨床研究證實(shí)，電刺激能夠加速創(chuàng)面的愈合。在創(chuàng)面愈合過(guò)程中，細(xì)胞的遷移和增殖是創(chuàng)面再上皮化的兩個(gè)重要的方面。近年來(lái)，細(xì)胞在電場(chǎng)中遷移的有關(guān)研究較多，而用電流強(qiáng)度作為參數(shù)，觀察電流直接作用下，細(xì)胞增殖情況的研究較少。為進(jìn)一步探索電刺激加速創(chuàng)面愈合的機(jī)制，需建立以電流強(qiáng)度為參數(shù)的電刺激細(xì)胞培養(yǎng)模型。在此基礎(chǔ)上，觀測(cè)電流對(duì)細(xì)胞增殖情況的影響，探討其作用機(jī)制，以期更好的指導(dǎo)臨床實(shí)踐

2、。 目的： 1.在比較不同種類電極優(yōu)缺點(diǎn)的基礎(chǔ)上，完善電流刺激細(xì)胞裝置，通過(guò)對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞的電刺激培養(yǎng)，觀測(cè)電刺激對(duì)細(xì)胞周期變化的影響，建立穩(wěn)定的微電流刺激細(xì)胞體外培養(yǎng)的模型。2.HaCaT細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞性質(zhì)相似，而且具有來(lái)源豐富，遺傳穩(wěn)定的特點(diǎn)。觀測(cè)同一電流強(qiáng)度下，電刺激效應(yīng)與培養(yǎng)時(shí)間的關(guān)系，觀測(cè)不同時(shí)間對(duì)細(xì)胞增殖的影響，研究其時(shí)效關(guān)系；再者，研究不同電流強(qiáng)度對(duì)細(xì)胞增殖生長(zhǎng)的量效關(guān)系。 方法： 1.

3、按照實(shí)驗(yàn)要求，制作微電流發(fā)生器。2.直接加電，比較鎳鉻合金絲電極和純鉑金絲電極的優(yōu)缺點(diǎn)，制作培養(yǎng)小室。3.對(duì)人原代角質(zhì)形成細(xì)胞進(jìn)行電刺激培養(yǎng)，檢測(cè)細(xì)胞周期的變化，建立微電流刺激細(xì)胞生長(zhǎng)的體外培養(yǎng)模型。4.在此模型基礎(chǔ)上，用MTT比色法檢測(cè)不同培養(yǎng)時(shí)間電刺激(10μA，5分鐘/次，2次/天)對(duì)HaCaT細(xì)胞的增殖效應(yīng)，找出最大效應(yīng)出現(xiàn)的培養(yǎng)時(shí)間。在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)上，再進(jìn)行了細(xì)胞周期測(cè)定和PCNA免疫組化染色。5.在最大效應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)，通過(guò)MTT

4、比色法，檢測(cè)10μA，5分鐘/次，2次/天；50μA，5分鐘/次，2次/天；250μA，5分鐘/次，2次/天三種電刺激參數(shù)組合條件下對(duì)HaCaT細(xì)胞株增殖反應(yīng)的影響。 結(jié)果： 1.制成微電流發(fā)生器，輸出電流強(qiáng)度在4μA-1800μA范圍內(nèi)可調(diào)。經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間電刺激觀察，純鉑金絲電極小室，電極上未見(jiàn)電化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)物。 2.10μA，5分鐘/次，2次/天的電刺激4天使人原代角質(zhì)形成細(xì)胞在G0/G1期的百分率低于對(duì)照組，而PI

5、明顯高于對(duì)照組。 3.對(duì)HaCaT細(xì)胞株進(jìn)行10μA，5分鐘/次，2次/天條件下的電刺激培養(yǎng)，電刺激組每天的OD值均高于對(duì)照組。與對(duì)照組相比，電刺激組第四天和第五天的OD值，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中，電刺激組第四天G0/G1期細(xì)胞百分率明顯低于對(duì)照組，而PI卻顯著高于對(duì)照組，PCNA抗原陽(yáng)性率也明顯高于對(duì)照組。 4.電刺激電流強(qiáng)度分別為10μA、50μA、250μA，持續(xù)時(shí)間均為5分鐘/次，刺激次數(shù)均為2次/天。電刺激培養(yǎng)四

6、天時(shí)，10μA組的OD值顯著高于對(duì)照組，50μA組和250μA組明顯均低于對(duì)照組。250μA組可見(jiàn)細(xì)胞損傷、脫壁現(xiàn)象，50μA組未見(jiàn)明顯細(xì)胞損傷。 結(jié)論 1.微電流刺激角質(zhì)形成細(xì)胞增殖模型能滿足多種細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)的需要，為進(jìn)一步研究微電流對(duì)細(xì)胞生物行為的影響提供了新的技術(shù)平臺(tái)。 2.適當(dāng)?shù)碾娏鞔碳そM合能夠促進(jìn)人原代角質(zhì)形成細(xì)胞和HaCaT細(xì)胞的增殖。 3.過(guò)大的電流強(qiáng)度并不一定加速細(xì)胞的增殖，反而造成細(xì)胞