細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境的改善對(duì)真皮乳頭細(xì)胞誘導(dǎo)能力的影響及機(jī)制探討.pdf

1、毛囊是由上皮部分和真皮部分組成，這兩種成分的細(xì)胞的相互作用在毛囊的形成與生長(zhǎng)中發(fā)揮著重要的作用。毛囊上皮部分包括外根鞘、內(nèi)根鞘、毛母質(zhì)和毛干，這些上皮成分均由位于毛囊隆凸部位的上皮干細(xì)胞產(chǎn)生。
　　體內(nèi)動(dòng)物模型又包括注射法、小室法和皮瓣法，總的原理是將真皮乳頭細(xì)胞和上皮干細(xì)胞相混合，再用不同方法移植入裸鼠體內(nèi)，觀察體內(nèi)毛囊重建與生長(zhǎng)情況，從而模仿了真皮乳頭細(xì)胞誘導(dǎo)毛囊再生所需的體內(nèi)環(huán)境。但無論是注射法、小室法和皮瓣法均有各自的缺陷

2、，使真皮乳頭細(xì)胞的誘導(dǎo)能力受到了一定程度的損害并繼而影響毛囊的重建。
　　本研究擬從兩方面進(jìn)行研究，一是改良將真皮乳頭細(xì)胞移植入動(dòng)物體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停瑥亩鵀檎嫫と轭^細(xì)胞盡可能提供良好的體內(nèi)環(huán)境，以促進(jìn)毛囊的重建與生長(zhǎng);二是改良毛囊體外培養(yǎng)所需的環(huán)境，即培養(yǎng)基，使毛囊內(nèi)的真皮乳頭細(xì)胞的毛發(fā)誘導(dǎo)能力盡可能得到保留。該研究結(jié)果對(duì)于毛發(fā)體內(nèi)再生重建和治療各類毛發(fā)生長(zhǎng)缺陷性疾病提供了重要的理論和臨床實(shí)際意義。
　　目的:
　　1.

3、設(shè)計(jì)一種更簡(jiǎn)便、更有效的動(dòng)物模型，使移植入動(dòng)物體內(nèi)的真皮乳頭細(xì)胞的誘導(dǎo)能力得到最大限度的保留，從而促進(jìn)體內(nèi)毛囊重建。
　　2.改良毛囊器官培養(yǎng)的外壞境，即培養(yǎng)基，以恢復(fù)毛囊真皮乳頭細(xì)胞的部分誘導(dǎo)能力，從而使體外培養(yǎng)的毛囊的增殖期延長(zhǎng)。
　　方法:
　　1.裸鼠體內(nèi)毛囊重建模型的改良
　　1.1毛囊上皮組織與毛囊真皮細(xì)胞的制備:將出生24小時(shí)內(nèi)的C57BL/6J小鼠處死，用75％酒精浸泡消毒后取其背部全層皮膚，然后

4、用PBS液反復(fù)潤(rùn)洗，去除多余脂肪，放入含1％中性蛋白酶的DMEM消化液中，在4℃下消化過夜。次日將已消化過夜的皮膚取出，用鑷子可輕易分離上皮與真皮組織。將完整的上皮片臨時(shí)放入含10％小牛血清的Dulbecco's modifiedEagle's medium(DMEM)培養(yǎng)液(DMEM/10)的培養(yǎng)皿中待用。用顯微剪反復(fù)地將真皮組織剪成細(xì)小顆粒狀，然后放入0.2％膠原酶中在37℃下消化1小時(shí)。消化結(jié)束后，加入等量的DMEM/10，然后依

5、次用100微米和40微米的細(xì)胞濾網(wǎng)過濾，將所得的細(xì)胞懸液在200g下離心5分鐘，再將細(xì)胞沉淀塊重新懸浮于1毫升的DMEM/10液體中并計(jì)數(shù)。最后再次將細(xì)胞懸液離心并懸浮于20微升的DMEM/10中，使成泥漿狀。
　　1.2設(shè)計(jì)改良皮瓣法動(dòng)物模型:將1.5毫升離心管蓋子取下，修剪成一個(gè)約1.5cm2大小的圓形硅膠板。將制備的上皮片角質(zhì)層覆蓋在硅膠板的光滑面，使真皮面朝上。用微型吸管將泥漿樣的真皮懸液涂抹于上皮片的真皮面。將載有上皮片

6、及真皮細(xì)胞的硅膠板放于37℃的CO2孵箱中，蒸發(fā)掉多余的水分。將4-5周大的裸鼠腹腔內(nèi)注射1％戊巴比妥液麻醉，背部用0.5％聚維酮碘液消毒。在背部近臀部設(shè)計(jì)一切口線，切開皮膚潛行分離皮下，使行成一個(gè)能容納假體的空間，將載有上皮片及真皮細(xì)胞的硅膠板移植入已分離的皮下，再將切口縫合。
　　1.3為進(jìn)行對(duì)比，我們同時(shí)進(jìn)行了傳統(tǒng)皮瓣法的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，在裸鼠背部行三邊切口（約0.8×1cm），掀起整個(gè)皮膚層，植入一個(gè)載有上皮片及真皮細(xì)胞的薄層軟

7、硅膠片（約2.5×1.5cm），上皮片的真皮面同樣朝上，其余步驟同改良皮瓣法。1.4打開皮瓣觀察毛發(fā)生長(zhǎng)情況:當(dāng)背部皮膚明顯隆起并且顏色變黑時(shí)，我們?cè)O(shè)計(jì)三邊切口，切開皮膚打開皮瓣，向后翻轉(zhuǎn)使其暴露在外界環(huán)境中，再拉攏周圍的切口并間斷縫合以閉合創(chuàng)面。
　　1.5移植細(xì)胞的追蹤:為評(píng)估移植入裸鼠體內(nèi)的上皮細(xì)胞，我們選擇用GFP轉(zhuǎn)基因的C57BL/6J小鼠的背部上皮細(xì)胞片。為追蹤真皮細(xì)胞，我們用dilinoleyltetramethyl

8、indocarbocyanine perchlorate(DiⅠ)，一種橙紅色細(xì)胞膜熒光染料，來對(duì)真皮細(xì)胞進(jìn)行染色，再將其移植入裸鼠體內(nèi)。GFP上皮片與普通乳鼠真皮細(xì)胞混合后移植，DiⅠ染色的真皮細(xì)胞與普通乳鼠來源的上皮細(xì)胞片混合移植。1.6毛發(fā)生長(zhǎng)的評(píng)估:毛發(fā)生長(zhǎng)的評(píng)估分別通過外觀和組織學(xué)（HE染色石蠟切片及電鏡檢查）來觀察。
　　2.毛囊器官培養(yǎng)液的改良一溶菌酶在毛囊中的表達(dá)及對(duì)毛囊體外生長(zhǎng)的影響
　　2.1毛囊生長(zhǎng)周期

9、中的溶菌酶表達(dá)變化:分別將處于增殖期和衰退期的毛囊用4％多聚甲醛固定，然后用石蠟包埋、切片（厚度4μm），抗原還原處理后，分別用溶菌酶一抗(兔來源抗鼠，貨號(hào):SAB1306215，1∶1000; Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)和相應(yīng)第二抗體處理組織切片。然后DAB加蘇木精染色顯色。
　　2.2毛囊體外培養(yǎng):選擇4-5周大的C57BL/6J小鼠，從其觸須墊部位顯微分離出觸須毛囊，從中選擇處于增殖期的毛囊

10、并將其放入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)基包括500μlWilliams E培養(yǎng)液，濃度為2mML-谷氨酰胺，10mg/ml的胰島素，10ng/ml的氫化可的松和經(jīng)稀釋100倍的青霉素與鏈霉素雙抗液。每次試驗(yàn)將40根毛囊平均分成4組，分別加入溶菌酶1，5，10μg/ml或者不加溶菌酶。試驗(yàn)共重復(fù)3次。
　　2.3毛囊的毛干增加長(zhǎng)度與生長(zhǎng)周期的測(cè)量:我們使用倒置顯微鏡(IX71;Olympus Optical Co.Ltd，Tok

11、yo，Japan)分別在第0，1和3天拍照，觀察毛囊生長(zhǎng)周期的變化。
　　2.4Ki-67 and5-bromo-2'-deoxyuridine(BrdU)雙熒光染色:為了追蹤毛囊內(nèi)上皮干細(xì)胞的增殖情況，我們?cè)诿殷w外培養(yǎng)結(jié)束前12小時(shí)在培養(yǎng)基中加入10μM的BrdU。培養(yǎng)結(jié)束后我們挑選出仍處于增殖期的毛囊，放入4％多聚甲醛中固定24小時(shí)，石蠟包埋，切成4μm厚的薄片，經(jīng)抗原修復(fù)后，在4℃下用抗BrdU和Ki-67的混合一抗（兔抗

12、小鼠Ki-67，貨號(hào):AB9260，1∶1000; Millipore，Bedford，MA，USA和大鼠抗小鼠BrdU,貨號(hào):ab6326，1∶100; Abcam，Cambridge，MA，USA)孵育組織切片。接下來用相應(yīng)熒光二抗處理組織切片。細(xì)胞核再用4'，6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)復(fù)染。
　　2.5毛乳頭細(xì)胞培養(yǎng):毛乳頭從C57BL/6J鼠觸須毛囊的毛球部分離獲得，再將毛乳頭放入含4

13、型膠原酶的培養(yǎng)皿中消化3小時(shí)，然后放入含100 U/ml青霉素、100 mg/ml鏈霉素和20％小牛血清的DMEM中，在37℃、5％ CO2條件下培養(yǎng)。取出的毛乳頭共培養(yǎng)5天，每3天換一次培養(yǎng)液。當(dāng)細(xì)胞在培養(yǎng)皿中生長(zhǎng)接近至融合狀態(tài)時(shí)，將其以1∶3的比例進(jìn)行傳代。獲得的毛乳頭細(xì)胞暫放入DMEM/10液中等待下一步使用。
　　2.6蛋白免疫印跡法:將培養(yǎng)2代的毛乳頭細(xì)胞用5和10μg/ml的溶菌酶處理24小時(shí)，然后用RIPA裂解液提取

14、所有蛋白，然后使用10％SDS-PAGE將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜上，將膜分別用一抗在4℃下孵育過夜。一抗包括:兔抗小鼠LEF1，貨號(hào):ab85052，1∶400; Abcam)，兔抗小鼠堿性磷酸酶(ALP)，貨號(hào):sc-30203，1∶1000; SantaCruz Biotechnology)，和兔抗小鼠β-actin(ab8227，1∶1000;Abcam)。然后將膜用對(duì)應(yīng)的二抗在室溫下孵育1小時(shí)。免疫復(fù)合物用免疫印跡增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試

15、劑盒檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，用Image-Pro Plus6.0軟件(Media Cybernetics，Silver Spring，MD，USA)對(duì)條帶光密度值進(jìn)行分析。
　　3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示（x±SEM）。對(duì)于動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，兩組間數(shù)據(jù)比較采用unpaired t-test。對(duì)于毛囊器官培養(yǎng)的數(shù)據(jù)分析，多組之間的數(shù)據(jù)比較采用One-Way ANOVA分析，先檢

16、驗(yàn)方差是否相齊，若方差相齊，兩兩比較用Bonferroni test分析，方差不齊則應(yīng)用welch分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.與傳統(tǒng)皮瓣法相比，經(jīng)過我們改良的皮瓣法操作步驟更為簡(jiǎn)化，動(dòng)物在術(shù)中失血更少，術(shù)后不僅能產(chǎn)生正常形態(tài)和密度的毛發(fā)，而且能明顯縮短真皮乳頭細(xì)胞在體內(nèi)誘導(dǎo)毛囊重建所需的時(shí)間。
　　2.我們發(fā)現(xiàn)溶菌酶主要表達(dá)在增殖期毛囊的真皮部位（真皮乳頭和真皮鞘），而在衰退期的表達(dá)明