shRNA誘導(dǎo)RUNX3沉默對SGC7901細(xì)胞系生長的影響及機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　本研究運(yùn)用RNA干擾(RNA interference, RNAi)技術(shù),沉默抑癌基因RUNX3的表達(dá),觀察RUNX3基因轉(zhuǎn)錄水平沉默對人胃癌細(xì)胞系SGC7901生長增殖的影響,并探討其可能機(jī)制。
　　方法:
　　根據(jù)RNAi的設(shè)計(jì)原則,設(shè)計(jì)與合成靶向RUNX3基因啟動(dòng)子發(fā)卡樣特異性干擾寡核苷酸序列(short hairpin RNAs,shRNAs);構(gòu)建特異性真核表達(dá)載體pSilencer3.1-H1-

2、shRNA/RUNX3,將重組的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染SGC7901細(xì)胞系,經(jīng)G418篩選,RT-PCR、Western blotting及SP免疫細(xì)胞化學(xué)方法,鑒定與檢測RUNX3基因mRNA及蛋白質(zhì)質(zhì)表達(dá)水平的變化,獲得RUNX3基因穩(wěn)定表達(dá)沉默的pSilencer3.1-H1-shRNA/RUNX3/SGC7901細(xì)胞系;擴(kuò)大培養(yǎng)陽性細(xì)胞克隆,通過繪制RUNX3基因表達(dá)沉默的SGC7901細(xì)胞系生長曲線、檢測其克隆形成率、分析細(xì)胞周期改

3、變,觀察RUNX3基因表達(dá)沉默對SGC7901細(xì)胞生長增殖的影響,經(jīng)HE染色,觀察細(xì)胞形態(tài)改變;然后應(yīng)用不同濃度的特異性DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5'-氮雜-2'-脫氧胞苷(5'-Aza-2'-deoxycytidine,5-Aza-CdR)處理 pSilencer3.1-H1-shRNA/ RUNX3/SGC7901細(xì)胞系,運(yùn)用 RT-PCR和Western blotting方法,檢測RUNX3基因mRNA及蛋白質(zhì)質(zhì)表達(dá)水平。
　　

4、結(jié)果:
　　重組質(zhì)粒 DNA經(jīng)酶切和測序鑒定,結(jié)果均證實(shí) pSilencer3.1-H1-RUNX3-shRNA真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。采用 Lipofectamine2000脂質(zhì)體將pSilencer3.1-H1-RUNX3-shRNA和pSilencer3.1-H1空載體分別轉(zhuǎn)染SGC7901細(xì)胞,G418篩選,陽性細(xì)胞克隆,經(jīng)RT-PCR、Western blotting及SP免疫細(xì)胞化學(xué)方法,進(jìn)行鑒定,成功建立RUNX3表達(dá)

5、沉默的SGC7901細(xì)胞系。繪制細(xì)胞生長曲線結(jié)果表明: pSilencer3.1-H1-shRNA/RUNX3/SGC7901組較轉(zhuǎn)空載體組和未轉(zhuǎn)染組,細(xì)胞生長增殖速度加快(P<0.05),而轉(zhuǎn)空白載體組和未轉(zhuǎn)染組生長速度相近(P>0.05)。軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)pSilencer3.1-H1-shRNA/RUNX3基因組細(xì)胞集落形成率為(17.4±0.31)％,轉(zhuǎn)空載體組和未轉(zhuǎn)染組的集落形成率分別為(9.9±0.3)%和(9

6、.7±0.6)%,轉(zhuǎn)基因組細(xì)胞集落形成率明顯高于轉(zhuǎn)空載體組和未轉(zhuǎn)染組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。進(jìn)一步采用流式細(xì)胞儀,檢測RUNX3基因表達(dá)沉默對SGC7901細(xì)胞周期的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:RUNX3基因表達(dá)沉默組與轉(zhuǎn)空白載體組和未轉(zhuǎn)染組相比較, RUNX3基因表達(dá)沉默組細(xì)胞群體中,處于G0/G1期細(xì)胞比例降低,而S期細(xì)胞比例增高,差異具有顯著性意義(P<0.05),而轉(zhuǎn)空白載體組和未轉(zhuǎn)染組間細(xì)胞周期改變差異無顯著性意義(P<

7、0.05)。HE染色,光鏡觀測顯示:三組細(xì)胞均為中分化粘液腺癌,其中RUNX3基因表達(dá)沉默組細(xì)胞核分裂增多,可見多個(gè)瘤巨細(xì)胞。經(jīng)不同濃度的5-Aza-CdR處理轉(zhuǎn)染pSilencer3.1-H1-shRNA/RUNX3/SGC7901細(xì)胞,經(jīng)RT-PCR及Western blotting方法檢測,研究結(jié)果顯示,5-Aza-CdR未能恢復(fù)RUNX3基因在pSilencer3.1-H1-shRNA/RUNX3/SGC7901細(xì)胞中的表達(dá)。<

8、br>　　結(jié)論:
　　1.構(gòu)建pSilencer3.1-H1-shRNA/RUNX3真核表達(dá)載體,成功建立RUNX3基因表達(dá)沉默的pSilencer3.1-H1-shRNA/RUNX3/SGC7901細(xì)胞系。
　　2.RUNX3基因在SGC7901細(xì)胞系表達(dá)沉默,使SGC7901細(xì)胞生長增殖速度加快,軟瓊脂克隆形成能力增強(qiáng),細(xì)胞群體中 G0/G1期細(xì)胞比例降低,S期細(xì)胞比例增高,病理性核分裂像多見,并可見瘤巨細(xì)胞。