柚皮素對(duì)人胃癌SGC7901細(xì)胞的影響及其相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、胃癌（gastric cancer, GC）是世界上癌癥致死的第二大因素，在中國(guó)GC患者的死亡數(shù)量占所有癌癥患者死亡數(shù)量的約23﹪。作為一種高度惡性的腫瘤，GC具有無(wú)限制性細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等特性。和其它惡性腫瘤一樣，GC的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程。首先，癌細(xì)胞無(wú)限制性生長(zhǎng)；然后癌細(xì)胞自原發(fā)腫瘤脫落并侵襲至周?chē)M織或進(jìn)入血管和淋巴管；最終，癌細(xì)胞停留并定居在靶器官并形成轉(zhuǎn)移腫瘤。大多數(shù)的GC病人在確診時(shí)已進(jìn)入晚期，盡管放化療已用于治療

2、GC，但GC的預(yù)后仍不樂(lè)觀。
　　中藥取材方便、價(jià)廉、毒副作用小，故中藥及其有效成分抗腫瘤的機(jī)制研究已成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。柚皮素（naringenin，Nar），自柑橘類(lèi)水果中提取，屬于二氫黃酮類(lèi)化合物。它的生物活性廣泛，包括：抗癌基因活性、抗動(dòng)脈粥樣硬化活性、抗炎作用、抗氧化作用等。和其它黃酮類(lèi)化合物一樣，Nar可以通過(guò)一系列作用機(jī)制抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，例如：破壞口腔鱗狀細(xì)胞癌的細(xì)胞周期進(jìn)程，抑制人K562細(xì)胞白血病的細(xì)胞增殖

3、。另有報(bào)道顯示，Nar可以抑制癌細(xì)胞的遷移、轉(zhuǎn)移和組織侵襲。有研究證實(shí)，Nar對(duì)幾種典型的癌癥具有有效的抗癌作用，例如：膀胱癌、肝癌、乳腺癌和結(jié)腸癌。Nar的器官特異性癌癥化療作用和療效已被公認(rèn)并且Nar被認(rèn)為是癌癥的一種化療或治療藥物。而且，Nar對(duì)GC的初步抗癌活性也已被證實(shí)。近幾年的研究顯示Nar不僅可以抑制GC中的beta-catenin/Tcf信號(hào)通路，還可以上調(diào)GC誘導(dǎo)大鼠的氧化還原狀態(tài)從而降低患癌的風(fēng)險(xiǎn)。然而，Nar對(duì)GC

4、發(fā)展轉(zhuǎn)移的影響及其作用機(jī)制仍有待闡明。
　　基于上述研究，為了進(jìn)一步了解Nar對(duì)GC是否具有治療作用，我們研究了：(1) Nar對(duì)人胃癌SGC7901細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖的影響。(2) Nar對(duì)人胃癌SGC7901細(xì)胞遷移和侵襲的影響。(3) Nar對(duì)人胃癌SGC7901細(xì)胞凋亡的影響。(4) Nar對(duì)人胃癌SGC7901細(xì)胞AKT信號(hào)通路的影響。最終闡明了Nar可以明顯抑制人胃癌SGC7901細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。這

5、些作用與AKT的磷酸化抑制和下游靶因子的表達(dá)有關(guān)。為其進(jìn)一步的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)及理論依據(jù)。
　　第一部分 Nar對(duì)人胃癌SGC7901細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖的影響
　　目的：研究Nar對(duì)人胃癌SGC7901細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖的影響，明確Nar對(duì)人胃癌SGC7901細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖是否具有抑制作用。
　　方法：SGC7901細(xì)胞為人GC細(xì)胞，購(gòu)買(mǎi)于上海生命科學(xué)細(xì)胞資源中心，并將細(xì)胞在RPMI1640培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)基中含有：10

6、％胎牛血清、100 units/mL青霉素、100 mg/mL鏈霉素。培養(yǎng)箱的CO2濃度維持在5%，溫度維持在37℃。濃度為0.25%的胰酶（含有0.02% EDTA）用于細(xì)胞傳代，每周2~3次。
　　采用四甲基噻唑藍(lán)法（methyl thiazolyl tetrazolium, MTT）研究Nar對(duì)人胃癌SGC7901細(xì)胞生長(zhǎng)率的影響。將SGC7901細(xì)胞以每孔1×104個(gè)細(xì)胞的密度接種在96孔板中并孵育24h，每種處理方式設(shè)6

7、個(gè)復(fù)孔。用不同濃度(0、5、10、20、40、80、160μmol/L)的Nar處理SGC7901細(xì)胞48h，另外用40μmol/L的Nar處理SGC7901細(xì)胞0、24、48和72h，觀察SGC7901細(xì)胞生長(zhǎng)率的變化。
　　采用 Western-blot法檢測(cè)人胃癌 SGC7901細(xì)胞增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）蛋白的表達(dá)變化。用濃度為0、20、40、80μm

8、ol/L的Nar處理SGC7901細(xì)胞48h后收集細(xì)胞，用于實(shí)驗(yàn)。觀察人胃癌SGC7901細(xì)胞增殖活性的變化。
　　結(jié)果：
　　1 MTT結(jié)果顯示：Nar濃度為5μmol/L時(shí)，SGC7901細(xì)胞的生長(zhǎng)率沒(méi)有明顯的改變。但是，濃度為10、20、40、80和160μmol/L時(shí)，Nar對(duì)SGC7901細(xì)胞的生長(zhǎng)率起劑量依賴性抑制作用（P<0.05）；同時(shí)，Nar濃度為40μmol/L，分別處理SGC7901細(xì)胞0、24、48和

9、72h時(shí)，Nar對(duì)SGC7901細(xì)胞的生長(zhǎng)率起時(shí)間依賴性抑制作用（P<0.05）。
　　2 Western-blot結(jié)果顯示：Nar濃度為0、20、40和80μmol/L時(shí)，Nar對(duì)SGC7901細(xì)胞PCNA蛋白表達(dá)起劑量依賴性抑制作用（P<0.05）。
　　結(jié)論：Nar呈劑量、時(shí)間依賴性的抑制人胃癌SGC7901細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖。
　　第二部分 Nar對(duì)人胃癌SGC7901細(xì)胞遷移和侵襲的影響
　　目的：研究N

10、ar對(duì)人胃癌SGC7901細(xì)胞遷移和侵襲的影響，進(jìn)而探討Nar對(duì)人胃癌SGC7901細(xì)胞遷移和侵襲的作用及其可能的作用機(jī)制。
　　方法：細(xì)胞培養(yǎng)方法同第一部分。
　　細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)用于檢測(cè) Nar對(duì)人胃癌 SGC7901細(xì)胞遷移的影響。SGC7901細(xì)胞以每孔5×104個(gè)細(xì)胞的密度接種在12孔培養(yǎng)板內(nèi)，生長(zhǎng)至80~90%融合后用于實(shí)驗(yàn)。用200μL槍頭將單層細(xì)胞劃痕后用PBS沖洗兩遍，然后用濃度為0、20、40、80μmol/

11、L的Nar處理SGC7901細(xì)胞48h，另外用40μmol/L的Nar處理SGC7901細(xì)胞24、48和72h，觀察SGC7901細(xì)胞遷移活性的變化。細(xì)胞遷移活性用遷移至劃痕處的細(xì)胞數(shù)量來(lái)表示。
　　Transwell小室法用于檢測(cè)Nar對(duì)人胃癌SGC7901細(xì)胞侵襲活性的影響。用濃度為0、20、40、80μmol/L的Nar處理SGC7901細(xì)胞48h，另外用40μmol/L的Nar處理SGC7901細(xì)胞24,48和72h，觀察

12、SGC7901細(xì)胞侵襲活性的變化。
　　實(shí)時(shí)定量RT-PCR和Western-blot用于檢測(cè)人胃癌SGC7901細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP2和MMP9）及其抑制劑（TIMP1和TIMP2）的mRNA和蛋白的表達(dá)變化。用濃度為0、20、40、80μmol/L的Nar處理SGC7901細(xì)胞48h后收集細(xì)胞，用于實(shí)驗(yàn)。
　　結(jié)果：
　　1細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：Nar濃度為0、20、40和80μmol/L時(shí)， Nar對(duì) SG

13、C7901細(xì)胞的遷移活性起劑量依賴性抑制作用（P<0.05）；同時(shí)，Nar濃度為40μmol/L，分別處理SGC7901細(xì)胞24，48和72h時(shí)， SGC7901細(xì)胞的遷移活性與對(duì)照組比較明顯下降（P<0.05）。
　　2 Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:Nar濃度為0、20、40和80μmol/L時(shí)， Nar對(duì) SGC7901細(xì)胞的侵襲活性起劑量依賴性抑制作用（P<0.01）；同時(shí)，Nar濃度為40μmol/L，分別處理SG

14、C7901細(xì)胞24、48和72h時(shí)， SGC7901細(xì)胞的遷移活性與對(duì)照組比較明顯下降（P<0.01）。
　　3實(shí)時(shí)定量RT-PCR和Western-blot結(jié)果顯示：Nar濃度為0、20、40和80μmol/L時(shí)，Nar對(duì)SGC7901細(xì)胞MMP2和MMP9的mRNA和蛋白表達(dá)呈劑量依賴性抑制作用（P<0.05），但對(duì)TIMP1和TIMP2表達(dá)沒(méi)有明顯影響。
　　結(jié)論：Nar可以抑制人胃癌 SGC7901細(xì)胞的遷移和侵襲活

15、性，并且降低MMP2和MMP9的表達(dá)。表明Nar可能通過(guò)降低MMP2和MMP9的表達(dá)對(duì)人胃癌SGC7901細(xì)胞的遷移和侵襲發(fā)揮抑制性調(diào)節(jié)作用。
　　第三部分 Nar對(duì)人胃癌SGC7901細(xì)胞凋亡的影響
　　目的：研究Nar對(duì)人胃癌SGC7901細(xì)胞凋亡的影響，進(jìn)而探討Nar對(duì)人胃癌SGC7901細(xì)胞凋亡作用及其可能的作用機(jī)制。
　　方法：細(xì)胞培養(yǎng)方法同第一部分。
　　流式細(xì)胞術(shù)用于檢測(cè)人胃癌 SGC7901細(xì)胞的

16、凋亡率。用濃度為0、20、40和80μmol/L的Nar處理SGC7901細(xì)胞48h，另外用40μmol/L的Nar處理SGC7901細(xì)胞24、48和72 h后，用Annexin V-FITC孵育細(xì)胞，然后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。
　　實(shí)時(shí)定量RT-PCR和Western-blot用于檢測(cè)人胃癌SGC7901細(xì)胞凋亡相關(guān)因子Bax、Bcl-2、Survivin和Cleaved-Caspase-3的mRNA和蛋白的表達(dá)變化。用濃

17、度20、40和80μmol/L的Nar處理SGC7901細(xì)胞48h后收集細(xì)胞，用于實(shí)驗(yàn)。
　　結(jié)果：
　　1流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示：Nar濃度為0、20、40和80μmol/L時(shí)，Nar對(duì)SGC7901細(xì)胞的凋亡率起劑量依賴性促進(jìn)作用（P<0.05）；同時(shí)，Nar濃度為40μmol/L，分別處理SGC7901細(xì)胞24、48和72h時(shí)，SGC7901細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組比較明顯增加（P<0.05）。
　　2實(shí)時(shí)定量RT-PCR

18、和Western-blot結(jié)果顯示：Nar濃度為20、40和80μmol/L時(shí)，SGC7901細(xì)胞的促凋亡因子 Bax和 Cleaved-Caspase-3的mRNA和蛋白表達(dá)明顯增加（P<0.05），而抑制凋亡的Bcl-2和Survivin的mRNA和蛋白表達(dá)明顯減少（P<0.05）。
　　結(jié)論：Nar以劑量和時(shí)間依賴性促進(jìn)人胃癌 SGC7901細(xì)胞的凋亡。Nar通過(guò)增加 SGC7901細(xì)胞的促凋亡因子 Bax和 Cleaved

19、-Caspase-3的mRNA和蛋白表達(dá)，減少抑制凋亡因子Bcl-2和Survivin的mRNA和蛋白表達(dá)而起到促進(jìn)SGC7901細(xì)胞的凋亡作用。
　　第四部分 Nar對(duì)人胃癌SGC7901細(xì)胞AKT信號(hào)通路的影響
　　目的：研究Nar對(duì)人胃癌SGC7901細(xì)胞AKT信號(hào)通路的影響，進(jìn)而探討Nar是否通過(guò)下調(diào)AKT信號(hào)通路抑制人胃癌SGC7901細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。
　　方法：細(xì)胞培養(yǎng)方法同第一部分。

20、
　　首先，分別用濃度為0、20、40和80μmol/L的Nar對(duì)SGC7901細(xì)胞進(jìn)行處理，時(shí)間為24、48和72h；然后收集細(xì)胞進(jìn)行Western-blot檢測(cè)。檢測(cè)指標(biāo)為：AKT和p-AKT(磷酸化AKT)。
　　然后，將細(xì)胞分為四組：1組，不用任何試劑處理；2組，用濃度為50μmol/L的LY294002（AKT抑制劑）處理SGC7901細(xì)胞2h；3組，濃度為40μmol/L的Nar處理SGC7901細(xì)胞48h；4組

21、，首先用濃度為50μmol/L的LY294002處理SGC7901細(xì)胞2h，然后用濃度為40μmol/L的Nar處理SGC7901細(xì)胞48h。最后，用MTT檢測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)率；用劃痕實(shí)驗(yàn)和 transwell小室檢測(cè)法檢測(cè)細(xì)胞的遷移和侵襲活性；用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況；用Western-blot檢測(cè)上述活性相關(guān)因子和AKT信號(hào)通路的蛋白表達(dá)情況，檢測(cè)指標(biāo)為：PCNA、Bax、Bcl-2、MMP2、MMP9、TIMP1、TIMP2、A

22、KT和p-AKT。
　　結(jié)果：
　　1 Nar對(duì)人胃癌SGC7901細(xì)胞AKT蛋白表達(dá)和磷酸化的影響。
　　Western-blot研究結(jié)果顯示：Nar以劑量和時(shí)間依賴方式抑制SGC7901細(xì)胞AKT的磷酸化，但AKT蛋白表達(dá)沒(méi)有明顯的變化。
　　2 Nar和AKT抑制劑LY294002對(duì)人胃癌SGC7901細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。
　　MTT研究結(jié)果顯示：Nar和LY294002均能降低SGC7901細(xì)胞的生長(zhǎng)率

23、（P<0.01），并且兩種藥物共同作用于細(xì)胞時(shí)會(huì)進(jìn)一步降低SGC7901細(xì)胞的生長(zhǎng)率（P<0.01）。
　　3 Nar和AKT抑制劑LY294002對(duì)人胃癌SGC7901細(xì)胞遷移和侵襲的影響。
　　細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：Nar和LY294002均能降低SGC7901細(xì)胞的遷移活性（ P<0.01），并且兩種藥物共同作用于細(xì)胞時(shí)會(huì)進(jìn)一步降低SGC7901細(xì)胞的遷移活性（P<0.01）。
　　Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果

24、顯示：Nar和 LY294002均能降低 SGC7901細(xì)胞的侵襲活性（P<0.01），并且兩種藥物共同作用于細(xì)胞時(shí)會(huì)進(jìn)一步降低SGC7901細(xì)胞的侵襲活性（P<0.01）。
　　4 Nar和AKT抑制劑LY294002對(duì)人胃癌SGC7901細(xì)胞凋亡的影響。
　　流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示：Nar和LY294002均能促進(jìn)SGC7901細(xì)胞凋亡（P<0.01），并且兩種藥物共同作用于細(xì)胞時(shí)會(huì)進(jìn)一步促進(jìn) SGC7901細(xì)胞的凋亡（P<

25、0.01）。
　　5 Nar和AKT抑制劑LY294002對(duì)人胃癌SGC7901細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、凋亡相關(guān)因子及AKT蛋白表達(dá)和磷酸化的作用。
　　為了進(jìn)一步確認(rèn) Nar與 AKT抑制劑 LY294002聯(lián)合使用對(duì)人胃癌SGC7901細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、凋亡及AKT蛋白表達(dá)和磷酸化的作用機(jī)制，采用Western-blot方法檢測(cè)了PCNA、Bax、Bcl-2、MMP2、MMP9、TIMP1、TIMP2、AKT和p-AK

26、T的表達(dá)變化。
　　Western-blot研究結(jié)果顯示：Nar和LY294002均能增加SGC7901細(xì)胞Bax的表達(dá)（P<0.05），并且兩種藥物共同作用于SGC7901細(xì)胞時(shí)會(huì)進(jìn)一步增加其表達(dá)（P<0.05,）；Nar和LY294002均能降低SGC7901細(xì)胞PCNA、Bcl-2、MMP2、MMP9、p-AKT的表達(dá)（P<0.05），并且兩種藥物共同作用于細(xì)胞時(shí)會(huì)進(jìn)一步降低其的表達(dá)（P<0.05）；但是，Nar和LY294