從細胞生長和乙醇誘導細胞凋亡角度初步探討hEra的功能.pdf

1、Era廣泛分布于細菌、古細菌和真核生物中，是一個新的G蛋白亞家族。已有的研究結果顯示，原核生物era是生存的必需基因，Era參與細胞周期調(diào)控和蛋白合成，是細菌生長必需的GTPase分子；真核生物Era的研究目前主要以人Era（hEra）為主，研究發(fā)現(xiàn)hEra在多種正常組織中表達，但其具體功能和確切機制還不清楚。因此，進一步研究Era的功能不僅有利于我們認識Era這一新的G蛋白亞家族，更能使我們對細胞生長和凋亡這樣重要的生理過程有進一步的

2、了解。
　　hera基因(hera)位于人17號染色體長臂11.2，是我室陳蘇民教授1999年克隆并定位的。2000年陳教授發(fā)現(xiàn)hera-mRNA存在兩種不同的剪接方式：hEra和hEraII。我室前期主要研究hEraII的功能，發(fā)現(xiàn)hEraII與細胞生長和凋亡相關；本研究以hEra為主要研究對象，利用完全可誘導真核生物表達系統(tǒng)，對hEra在細胞生長、細胞周期和低濃度乙醇誘導細胞凋亡中的作用進行了研究。然后選取低濃度乙醇誘導細胞凋

3、亡的常用實驗材料肝癌細胞HepG2，對其heraRNAi后觀察腫瘤細胞相關的生理變化。
　　主要研究結果：
　　1.hEra的功能與細胞生長和乙醇誘導的細胞凋亡相關。
　　本實驗采用的“完全可誘導哺乳類表達系統(tǒng)”由受體載體pERV3和可表達目的基因的表達載體pEGSH組成，在昆蟲蛻皮激素的類似物PonasteroneA（PonA）誘導下可表達目的基因。這個可調(diào)控表達系統(tǒng)具有高的誘導表達水平和快速開（turnon）關(t

4、urnoff)效應等特點，是一種利用基因轉導技術來研究基因功能的強有力手段。
　　利用完全可誘導真核生物表達系統(tǒng)，我們將hEra在HEK293細胞中穩(wěn)定轉染，誘導穩(wěn)定表達。細胞形態(tài)和生長曲線結果提示hEra的過表達能促進細胞生長，細胞周期檢測顯示野生型hEra能使G1期細胞降低，S期細胞增多；細胞同步化實驗證明hEra的高表達促進細胞進入S期，使細胞在G1期持續(xù)時間縮短（誘導前為17.82h，誘導后為14.13h）；Western

5、blot實驗說明hEra能上調(diào)cyclinD在蛋白水平的表達；用化學合成siRNA對hEraRNAi后HepG2細胞生長受到抑制。這些實驗結果提示hEra可能通過間接上調(diào)cyclinD的蛋白表達來促進細胞快速進入S期，加快細胞生長和分裂進程。
　　在我們建立的低濃度乙醇誘導細胞凋亡模型中，發(fā)現(xiàn)hEra的高表達能在一定程度上抑制低濃度乙醇誘導的細胞凋亡，而且可以上調(diào)c-jun的mRNA表達，下調(diào)促凋亡蛋白Bax的蛋白表達。提示hEr

6、a對低濃度乙醇誘導細胞凋亡的抑制與轉錄因子AP-1相關，這為下一步研究hEra的相關分子機制提供了線索。
　　2.hEraN端在細胞生長分裂和乙醇誘導的細胞凋亡中起重要作用。
　　為研究hEraN端的功能，我們構建了2種突變體：1種點突變heraS127N（對應于野生型人Era蛋白的G結構域）和1種截短突變hera1-343（對應截短去掉人Era蛋白的C端KH結構域）。將其分別克隆于可誘導表達載體系統(tǒng)中，轉染于已穩(wěn)定轉染受體

7、載體pERV3的HEK293細胞，誘導表達后，觀察對細胞的影響。
　　我們觀察到誘導表達的hEraN端GTPase結構域的完整表達即hEra1-343也能促進細胞生長，但誘導表達的N端相應的單點突變體hEraS127N則不能，相應的細胞周期檢測也印證了這一點，因此我們認為hEraN端GTPase結構域的完整對細胞的生長有積極意義。
　　在低濃度乙醇誘導細胞凋亡的研究中，誘導表達的N端截短體hEra1-343也能有效抑制乙醇誘

8、導的細胞凋亡，而誘導表達的N端相應的單點突變體hEraS127N對這種凋亡沒有抑制作用。說明hEraN端GTPase結構域的完整不僅對細胞的生長有積極意義，而且在抑制凋亡中也起重要作用。實驗表明，誘導表達的hEra1-343能上調(diào)c-junmRNA的表達水平，下調(diào)c-myc的mRNA和促凋亡蛋白Bax的蛋白表達。提示hEraN端在體內(nèi)可以獨立行使某些生物學功能。
　　3.hEraC端KHdomain的活性在hEra的功能行使中可能

9、起“錨定”作用。
　　如結果2所述，用同樣方法我們構建另2種突變體：heraI401N（對應于野生型人Era蛋白的KH結構域）和1種截短突變hera?329（對應截短去掉人Era蛋白的N端GTP結構域）。將其分別克隆于可誘導表達載體系統(tǒng)中，轉染于已穩(wěn)定轉染受體載體pERV3的HEK293細胞，誘導表達后，觀察對細胞的影響。
　　當hEraN端GTPase結構域完全缺失即只有KH結構域的截短體hEra?329誘導表達時，細胞生

10、長受到嚴重抑制，細胞周期檢測在G2/M期發(fā)生阻滯，提示C端KHdomain在hEra功能的行使中有重要作用，而且hEra對細胞的G2/M期也有一定影響。表明誘導表達的hEra?329對細胞生長的抑制是hEra?329對內(nèi)源hEra的dominatenegative效應。
　　結合上述實驗現(xiàn)象，我們推測：KH結構域是hEra行使功能的“錨定區(qū)”，GTP結合結構域是“催化區(qū)”。在GTP結構域發(fā)生突變時的點突變體hEraS127N中，K

11、H結構域使突變的hEra仍然錨定在作用靶點，但GTP結合結構域不能行使功能，從而直接或間接影響細胞生長；當GTP結構域缺失后（即hEra?329），KH結構域與內(nèi)源hEra競爭結合作用靶點，使細胞生長受到嚴重抑制，細胞曲線明顯右移。
　　綜合上述研究結果，我們認為hEra在功能上與細胞生長相關，其高表達能抑制低濃度乙醇引起的細胞凋亡。N端GTPase結構域在hEra發(fā)揮功能中起重要作用，C端的KH結構域在hEra發(fā)揮功能中可能起“