新型乙腦-登革4嵌合病毒的構(gòu)建與生物學(xué)性質(zhì)評(píng)價(jià).pdf

1、登革病毒（dengue virus)屬于黃病毒科黃病毒屬，是一種單股正鏈的 RNA病毒，全長(zhǎng)約11kb，含有一個(gè)單一的開(kāi)放讀碼框，開(kāi)放讀碼框可依次編碼3種結(jié)構(gòu)蛋白（C、PrM和E）和7種非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5）。結(jié)構(gòu)蛋白主要參與病毒與宿主細(xì)胞的吸附及病毒顆粒的組裝；其中E蛋白是對(duì)病毒感染起保護(hù)性免疫作用的抗原。非結(jié)構(gòu)蛋白則主要在病毒基因組的復(fù)制和翻譯過(guò)程中發(fā)揮重要作用[1]。登革病毒（

2、dengue virus，DEN）包括4個(gè)血清型（DENV-1型，DENV-2型，DENV-3型，DENV-4型），其引起的登革熱是世界上分布最廣、發(fā)病人數(shù)最多、危害最嚴(yán)重的蚊媒疾病，廣泛流行于全球100多個(gè)國(guó)家[2]。由其感染所引起的疾病包括：無(wú)癥狀感染、一般性發(fā)熱、溫和的登革熱（dengue fever，DF）以及嚴(yán)重的登革出血熱（dengue hemorrhagic fever， DHF）和登革休克綜合征（dengue shock

3、 syndrome，DSS）[3]。接種疫苗是控制登革熱最重要的手段。由于抗體依賴(lài)增強(qiáng)感染效應(yīng)(Antibody-dependent enhancement,ADE)，理想的登革疫苗應(yīng)該是能夠誘導(dǎo)人體產(chǎn)生4種血清型 DENV均有免疫保護(hù)作用[4-6]。
　　進(jìn)展最快的登革疫苗是法國(guó)賽諾菲巴斯德公司的登革四價(jià)減毒活疫苗（ CYD-TDV），該疫苗已經(jīng)完成三期臨床試驗(yàn)，于2016年1月份在墨西哥率先上市,臨床數(shù)據(jù)顯示，該疫苗抵抗DEN

4、V-1、DENV-3、DENV-4的有效率分別為50.3％、74.0%、77.7%，但抗DENV-2的有效率只有42.3%[7,8]。該嵌合疫苗是以黃病毒家族（YF-17D）毒株骨架，再以4個(gè)血清型DENV病毒的同源序列（prM-E）替換骨架病毒的相應(yīng)基因得到的重組嵌合毒株，從而獲得合適的減毒效率和較強(qiáng)的免疫原性[9,10]。
　　我國(guó)研制的乙腦減毒活疫苗 SA14-14-2于1989年在中國(guó)被批準(zhǔn)上市，目前為止，已經(jīng)有超過(guò)3億兒

5、童接種疫苗。研究顯示，該疫苗株具有良好的減毒特性和安全性，單次免疫能有效誘導(dǎo)產(chǎn)生保護(hù)性的中和抗體，而且免疫力持久[11-13]。由于黃病毒的基因機(jī)構(gòu)、復(fù)制翻譯策略都非常相似，可以用分子生物學(xué)的方法相互改變黃病毒的基因，以構(gòu)建新的嵌合病毒[14-16]。李曉峰等[17]將DENV2的PreM-E蛋白基因成功插入SA-14-14-2為骨架中，構(gòu)建了ChinDENV2型嵌合疫苗，該嵌合病毒在小鼠和靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物上具有減毒效果。本研究擬以乙腦減毒活

6、疫苗SA14-14-2為骨架，將登革4型病毒PreME蛋白編碼基因替換進(jìn)SA14-14-2基因中，繼續(xù)構(gòu)建DENV4型嵌合疫苗，初步完成乙腦/登革4型嵌合病毒的構(gòu)建與生物學(xué)性質(zhì)評(píng)價(jià)。
　　本研究包括以下兩個(gè)部分：
　　一、乙腦/登革4型嵌合病毒的構(gòu)建。
　　嵌合病毒是利用反向遺傳學(xué)的方法，由結(jié)構(gòu)功能相似的同源或者異源病毒相互替換部分結(jié)構(gòu)基因而獲得的一種新的病毒，為了保證重組病毒的安全性，我們一般采用已知特性的病毒株，一

7、般多選用減毒株作為病毒載體。本研究利用乙腦減毒活疫苗 SA14-14-2為骨架，我們采用分子生物學(xué)的方法將疫苗株的PrM和E蛋白編碼基因替換為登革4型病毒（DENV4-GZ30）的PrM和E蛋白的相應(yīng)部分，構(gòu)成一種新的嵌合質(zhì)粒，命名為pChinDENV4。
　　通過(guò)酶切圖譜初步確定嵌合質(zhì)粒的大小和完整性,進(jìn)一步測(cè)定質(zhì)粒的全基因序列,運(yùn)用 DNA STAR軟件比對(duì)嵌合質(zhì)粒與病毒基因序列的差異。利用體外轉(zhuǎn)錄的方法，將嵌合質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄成RN

8、A，并且轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，約3天后細(xì)胞出現(xiàn)典型病變后，得到嵌合病毒。通過(guò)反轉(zhuǎn)錄PCR實(shí)驗(yàn)判斷病毒是否正確。測(cè)病毒cDNA序列，比對(duì)是否與原質(zhì)粒序列相同。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，我們能通過(guò)反向遺傳學(xué)的方法成功拯救出乙腦/登革4型嵌合病毒。嵌合病毒能夠在BHK-21細(xì)胞上復(fù)制。
　　二、乙腦/登革4型嵌合病毒生物學(xué)特性評(píng)價(jià)。
　　我們對(duì)嵌合病毒與其親本病毒在不同細(xì)胞系中的生長(zhǎng)特性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其與親本病毒株相比無(wú)顯著差

9、異。進(jìn)一步對(duì)嵌合病毒的蝕斑特征及在動(dòng)物體內(nèi)的神經(jīng)毒力和神經(jīng)侵襲力進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果顯示嵌合病毒的蝕斑大小介于兩親本株之間，其神經(jīng)毒力和神經(jīng)侵襲力與親本株弱。
　　綜上，本研究采用反向遺傳學(xué)的方法，構(gòu)建了一種新的登革乙腦嵌合病毒，通過(guò)將嵌合病毒與其親本病毒株生物學(xué)特性鑒定和比較，我們發(fā)現(xiàn)嵌合病毒在細(xì)胞上的復(fù)制生長(zhǎng)能力沒(méi)有降低，但毒力較其親本病毒株減弱，乙型/登革病毒反向遺傳學(xué)系統(tǒng)的建立為基因乙腦疫苗株骨架的新型登革病毒四價(jià)疫苗的研制奠