熒光定量PCR快速檢測(cè)登革1型病毒.pdf

1、一、研究背景和目的
　　 登革病毒(dengue virus，DEN)屬黃病毒科黃病毒屬，為單股正鏈RNA病毒，體積較小，約45～55nm，依抗原性不同分為四個(gè)血清型。登革病毒主要通過埃及伊蚊和白紋伊蚊等媒介昆蟲傳播，引起登革熱以及發(fā)病率和死亡率很高的登革出血熱和登革休克綜合征。登革病毒病流行于熱帶和亞熱帶地區(qū)，每年約有5000萬至1億人感染，是一種分布廣、發(fā)病多、危害較大的人類傳染病，已成為全球公共衛(wèi)生關(guān)注的焦點(diǎn)之一。

2、　　 登革熱的診斷目前主要依賴病毒分離培養(yǎng)以及血清中特異性IgM、IgG抗體測(cè)定，血清學(xué)診斷由于登革抗體與其他黃病毒存在交叉反應(yīng)，故存在一定的局限性;病毒的分離鑒定，由于費(fèi)時(shí)費(fèi)力，技術(shù)要求高，不適合臨床使用。分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，為登革熱的早期診斷提供了可能，應(yīng)用普通RT-PCR方法可在1天內(nèi)進(jìn)行登革病毒的鑒定和分型診斷，但該方法易造成標(biāo)本間的交叉污染而得到假陽性結(jié)果。TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，相對(duì)于常規(guī)的PCR技術(shù)而言

3、，具有更高的敏感性、特異性和重復(fù)性。而且還具有快速、高通量、污染少等特點(diǎn)。本研究欲建立更省時(shí)、特異，可對(duì)登革1型病毒進(jìn)行早期診斷的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法。
　　 隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在生物學(xué)研究中的應(yīng)用越來越廣泛。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。它在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上添加了熒光染料或熒光探

4、針。熒光染料能特異性摻入DNA雙鏈，發(fā)出熒光信號(hào)，而不摻入雙鏈中的染料分子不發(fā)出熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物增加完全同步。熒光探針法是將熒光共振能量傳遞技術(shù)應(yīng)用于常規(guī)PCR中，在探針的5’端標(biāo)記一個(gè)熒光報(bào)告基團(tuán)(R)，3'端標(biāo)記一個(gè)淬滅基團(tuán)(Q)，兩者可構(gòu)成能量傳遞結(jié)構(gòu)，即5’端熒光基團(tuán)所發(fā)出的熒光可被淬滅基團(tuán)吸收或抑制;當(dāng)兩者距離較遠(yuǎn)時(shí)，抑制作用消失，報(bào)告基團(tuán)熒光信號(hào)增強(qiáng)，熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)。利用以上熒光產(chǎn)生

5、原理，在PCR過程中可以連續(xù)不斷地檢測(cè)反應(yīng)體系中熒光信號(hào)的變化。當(dāng)信號(hào)增強(qiáng)到某一域值(PCR反應(yīng)的前15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào)，域值的缺省設(shè)置為3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍)時(shí)，Ct值被記錄下來。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含義是:每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。在這一技術(shù)的發(fā)展過程中，兩個(gè)重要的發(fā)現(xiàn)起著關(guān)鍵的作用:
　　 ①在20世紀(jì)90年代早期，TaqDN

6、A多聚酶的5’核酸外切酶活性的發(fā)現(xiàn)，它能降解特異性熒光標(biāo)記探針，因此使得間接地檢測(cè)PCR產(chǎn)物成為可能。
　　 ②此后熒光雙標(biāo)記探針的運(yùn)用使得在一個(gè)密閉的反應(yīng)管中實(shí)時(shí)地監(jiān)測(cè)反應(yīng)全過程成為可能。
　　 這兩個(gè)發(fā)現(xiàn)的結(jié)合以及相應(yīng)的儀器和試劑的商品化發(fā)展導(dǎo)致實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在研究工作中的廣泛運(yùn)用。1996年，美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司（Applied Biosystems，ABI）的ABIPrism7700和5700、羅氏公司(

7、Roehe)的Light Cycler TM等儀器率先投入商業(yè)使用。它們的擴(kuò)增和檢測(cè)全部自動(dòng)化、耗時(shí)短、工作效率高。國(guó)內(nèi)使用較多的有ABI Prism7000、7900、7700型和LightCylerTM等。ABIPrism7900等RQ-PCR儀可用于高通量（384孔板）檢測(cè)，而ABIPriSm7000則利用了多色多通道技術(shù)。目前最常用的實(shí)時(shí)熒光定量PCR產(chǎn)物的檢測(cè)技術(shù)都是應(yīng)用熒光染料或基團(tuán)，并將PCR與實(shí)時(shí)信號(hào)檢測(cè)相結(jié)合，其中最簡(jiǎn)

8、單的是雙鏈DNA嵌合熒光染料技術(shù)，該法成本低廉，但SYBRGreen熒光染料能與所有的DNA雙鏈相結(jié)合，特異性不如TaqMan探針法。要想用熒光染料法得到比較好的定量結(jié)果，對(duì)PCR引物設(shè)計(jì)的特異性和PCR反應(yīng)的質(zhì)量要求就比較高。而TaqMan探針法則是高度特異的定量PCR技術(shù)，其核心是利用Taq酶的3'-5’外切核酸酶活性，切斷探針，產(chǎn)生熒光信號(hào)。由于探針與模板是特異性結(jié)合，所以熒光信號(hào)的強(qiáng)弱就代表了模板的數(shù)量。隨著研究的深入及試劑的商

9、品化，又發(fā)展衍生出更多的熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)，如TaqMan MGB法、Molecular Beacon法、Amplisensor、Light cycler、complex probes等。
　　 二、研究方法
　　 1、引物探針設(shè)計(jì)及標(biāo)準(zhǔn)曲線建立:從GenBank中下載八十株不同年份和不同地區(qū)的登革1型病毒基因組全序列，登革2、3、4型病毒以及黃病毒屬其它病毒也各下載十株，尋找型內(nèi)保守型外特異的序列，使用Beacon

10、 Designer 7.0軟件設(shè)計(jì)引物探針。將含有保守序列的質(zhì)粒經(jīng)過10倍系列稀釋后，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)得到相應(yīng)的擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線。
　　 2、熒光定量PCR特異性、重復(fù)性、再現(xiàn)性、敏感性實(shí)驗(yàn):用建立的熒光定量PCR方法對(duì)登革1-4型病毒標(biāo)準(zhǔn)株以及乙型腦炎減毒活疫苗株進(jìn)行檢測(cè)。線性化后的質(zhì)粒10倍倍比稀釋6個(gè)濃度，從1.01×107稀釋到1.01×102copies/μl，分不同的時(shí)間重復(fù)三次，每次做三個(gè)重復(fù)孔，驗(yàn)證重復(fù)性

11、和再現(xiàn)性。此外，對(duì)PMDns2a質(zhì)粒進(jìn)行10倍倍比稀釋，熒光定量PCR檢測(cè)比較其敏感性，將擴(kuò)增片段反轉(zhuǎn)錄為RNA，進(jìn)行倍比稀釋做敏感性檢測(cè)。
　　 3、臨床標(biāo)本檢測(cè):對(duì)廣州市第八人民醫(yī)院提供的cDNA，以及對(duì)東莞疑似病人血清提取RNA并反轉(zhuǎn)錄的cDNA，進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，用登革病毒總引物探針進(jìn)行驗(yàn)證，并且根據(jù)Ct值對(duì)熒光定量PCR方法以及常規(guī)PCR方法進(jìn)行比較。
　　 三、研究結(jié)果
　　 1、引物探針設(shè)計(jì):

12、經(jīng)比對(duì)，在登革病毒序列的NS2A區(qū)尋找到一段80bp的序列，并設(shè)計(jì)了引物探針，引物探針與登革1型病毒比對(duì)，具有很好的保守性，與其它三型病毒以及黃病毒屬的其它病毒，比如日本腦炎病毒、基孔肯亞病毒、西尼羅河病毒以及發(fā)病相似的麻疹病毒比對(duì)，另外也與人的基因組進(jìn)行比對(duì)，都具有很好的特異性。
　　 2、標(biāo)準(zhǔn)曲線建立:得到標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R2=0.999，擴(kuò)增效率Eff=96.5％，回歸方程Y=-3.410logX+34.87（Y為Ct值，

13、X為模板濃度），并且對(duì)Ct值和模板濃度的對(duì)數(shù)值進(jìn)行相關(guān)與回歸分析，直線相關(guān)系數(shù)r=-1.000，P=0.000，回歸系數(shù)為-3.410，P=0.000，從中可以看出，所作的標(biāo)準(zhǔn)曲線的Ct值與初始濃度有較好的線性關(guān)系。
　　 3、特異性:對(duì)登革1,2，3，4型病毒提取核酸，采用本方法對(duì)登革1型病毒的擴(kuò)增結(jié)果為陽性，而對(duì)其它三型登革病毒以及乙型腦炎病毒提取核酸的擴(kuò)增結(jié)果均顯示為陰性，表明所建立的針對(duì)登革1型病毒的熒光定量PCR方法不

14、會(huì)受到其它三型登革病毒以及乙型腦炎病毒干擾。
　　 4、重復(fù)性和再現(xiàn)性:重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)差( SDr)在0.04與0.44之間，再現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)差(SDR)在0.14與0.29之間，變異系數(shù)＜2％，并且通過析因方差分析得濃度和時(shí)間之間不存在交互效應(yīng)( F=0.691，P=0.726)，不同稀釋濃度之間的Ct值有差異(F=10528.497，P=0.000);三個(gè)重復(fù)時(shí)間之間并無差異(F=0.451，P=0.641)。說明建立的方法具有良好的

15、重復(fù)性和再現(xiàn)性。
　　 5、敏感性:用本研究建立的熒光定量PCR方法檢測(cè)質(zhì)粒，敏感性可達(dá)到1copy/μl。用RNA進(jìn)行敏感性檢測(cè)，可達(dá)102copies/μl。并且對(duì)Ct值和RNA濃度的對(duì)數(shù)值進(jìn)行相關(guān)與回歸分析，直線相關(guān)系數(shù)r=-1.000，P=0.000，回歸系數(shù)為-3.305，P=0.000，認(rèn)為Ct值與RNA濃度的對(duì)數(shù)值直接存在直線回歸關(guān)系，得回歸方程Y=-3.305logX+39.727（Y為Ct值，X為RNA濃度）。

16、
　　 6、臨床標(biāo)本檢測(cè):對(duì)廣州市第八人民醫(yī)院提供的cDNA樣本以及東莞疑似病人血清進(jìn)行檢測(cè)。采用本研究所建立的登革1型病毒型特異引物探針進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，對(duì)本方法以及常規(guī)PCR方法進(jìn)行配對(duì)計(jì)數(shù)資料的卡方檢驗(yàn)(x2檢驗(yàn))，P＝0.000，表明兩種檢測(cè)方法有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而本研究方法陽性率明顯高于常規(guī)PCR方法，表明本研究方法優(yōu)于常規(guī)PCR。
　　 四、結(jié)論
　　 本研究成功設(shè)計(jì)了針對(duì)登革1型病毒的型特異性引物