漢灘病毒嵌合VLP的生物學(xué)活性鑒定及其長(zhǎng)效免疫效果研究.pdf

1、【研究背景】
　　漢灘病毒（ Hantaan virus, HTNV）感染在我國(guó)主要引起腎綜合征出血熱（Hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS），該病缺乏特異有效的治療藥物，通過(guò)疫苗接種預(yù)防HTNV感染成為控制疾病發(fā)生的主要手段。病毒樣顆粒（Virus like particle, VLP）是病毒生活周期中結(jié)構(gòu)蛋白自我組裝形成的不含病毒核酸的顆粒樣物質(zhì)，包括 HTNV在內(nèi)的部分病毒，

2、能夠通過(guò)基因工程方法表達(dá)病毒結(jié)構(gòu)蛋白合成VLP，VLP作為疫苗具有安全性高、免疫效果好的優(yōu)點(diǎn)。在VLP表面嵌合粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（Granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF）或CD40配體（CD40 ligand, CD40L）的免疫佐劑可提高其免疫效果。本實(shí)驗(yàn)室前期在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中成功表達(dá)了含有HTNV核衣殼蛋白（Nucleoprotein, NP）和包膜糖

3、蛋白（Glycoprotein, GP）的 HTNV VLP，并在此基礎(chǔ)上嵌合佐劑基因表達(dá)出 HTNV VLP-GM-CSF和HTNV VLP-CD40L。本研究旨在明確HTNV嵌合VLPs的生物學(xué)活性，并對(duì)其分別免疫小鼠后的長(zhǎng)效免疫效果進(jìn)行初步探討，為HTNV VLP疫苗的應(yīng)用提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　【研究方法】
　　三種HTNV VLPs（后文分別用VLP代表單純HTNV VLP，VLP-GM-CSF代表嵌合GM-CS

4、F的HTNV VLP，VLP-CD40L代表嵌合CD40L的HTNV VLP）分別與無(wú)菌分離的 C57BL/6小鼠骨髓細(xì)胞共培養(yǎng)，設(shè)置空白對(duì)照組，流式細(xì)胞術(shù)（Flow cytometry, FCM）檢測(cè)骨髓細(xì)胞中F4/80+CD11b+細(xì)胞、CD11c+細(xì)胞的數(shù)量以及MHC-Ⅱ、CD40、CD86分子的表達(dá)情況，以評(píng)價(jià)HTNV VLPs促進(jìn)骨髓細(xì)胞向抗原提呈細(xì)胞（Antigen presenting cell, APC）分化、成熟情況。

5、經(jīng)三種HTNV VLPs分別刺激的體外脾臟淋巴細(xì)胞中，以及經(jīng)其分別免疫小鼠后分離的脾臟淋巴細(xì)胞中，分別檢測(cè)CD4+CD25+細(xì)胞和 CD8+ CD25+細(xì)胞的數(shù)量以測(cè)定 T細(xì)胞增殖和活化情況，檢測(cè)B220+CD69+細(xì)胞數(shù)量以測(cè)定B細(xì)胞增殖和活化情況。
　　三種HTNV VLPs以及HTNV滅活疫苗分別免疫C57BL/6小鼠，設(shè)置生理鹽水對(duì)照組，初次免疫6個(gè)月后，以相同劑量加強(qiáng)免疫一次，檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組加強(qiáng)免疫前、后的體液免疫和細(xì)胞免

6、疫效果，初步評(píng)價(jià)HTNV VLPs的長(zhǎng)效免疫效果。間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme-linked immunoabsordent assay, ELISA）檢測(cè)抗HTNV特異性抗體水平，微量細(xì)胞中和實(shí)驗(yàn)檢測(cè)抗HTNV中和抗體水平來(lái)評(píng)價(jià)各實(shí)驗(yàn)組的長(zhǎng)效體液免疫效果；酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)（Enzyme-linked Immunospot assay, ELISPOT）測(cè)定細(xì)胞因子IFN-γ和IL-4分泌水平，細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（Cytotoxi

7、c T lymphocyte，CTL）殺傷實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)其長(zhǎng)效細(xì)胞免疫效果；加強(qiáng)免疫前、后，分別用HTNV攻擊免疫小鼠，通過(guò)雙抗體夾心 ELISA法檢測(cè)病毒抗原、實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)檢測(cè)病毒核酸、病理切片觀察實(shí)驗(yàn)小鼠臟器病理變化來(lái)評(píng)價(jià)其長(zhǎng)效免疫后的動(dòng)物保護(hù)作用。
　　【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】
　　FCM檢測(cè)結(jié)果顯示，三種HTN

8、V VLPs分別刺激的小鼠骨髓細(xì)胞F4/80+CD11b+細(xì)胞、CD11c+細(xì)胞數(shù)量以及MHC-Ⅱ、CD40和CD86分子表達(dá)水平均明顯升高，表明其有效地刺激了小鼠骨髓細(xì)胞向APC分化、成熟。三種HTNV VLPs體外分別刺激的小鼠脾臟淋巴細(xì)胞和經(jīng)其免疫后小鼠的脾臟淋巴細(xì)胞中 CD4+ CD25+、CD8+CD25+T細(xì)胞數(shù)量和B220+CD69+B細(xì)胞數(shù)量均明顯增高，表明HTNV VLPs均有效地促進(jìn)小鼠體內(nèi)及體外 T、B淋巴細(xì)胞增殖

9、和活化。其中，VLP-GM-CSF在促進(jìn)骨髓細(xì)胞向APC分化成熟方面和促進(jìn)小鼠體內(nèi)、外T細(xì)胞增殖和活化方面作用更為明顯。而在促進(jìn)小鼠體內(nèi)、外B淋巴細(xì)胞增殖和活化方面，VLP-CD40L的作用更為明顯。
　　長(zhǎng)效體液免疫結(jié)果顯示，HTNV滅活疫苗組小鼠血清中幾乎未檢測(cè)到抗 HTNV NP特異性抗體，且僅檢測(cè)到少量的中和抗體。HTNV VLPs分別免疫的小鼠血清中抗HTNV NP特異性抗體和中和抗體水平均高于HTNV滅活疫苗組，VLP

10、-GM-CSF和VLP-CD40L組小鼠抗HTNV NP特異性抗體與中和抗體水平高于VLP免疫組小鼠。加強(qiáng)免疫后，小鼠抗HTNV NP特異性抗體與中和抗體水平均比加強(qiáng)免疫前有所提高。長(zhǎng)效細(xì)胞免疫結(jié)果顯示，HTNV滅活疫苗組和生理鹽水對(duì)照組相比，IFN-γ分泌水平相當(dāng)，而三種HTNV VLPs分別免疫小鼠后，脾細(xì)胞IFN-γ分泌水平明顯高于HTNV滅活疫苗組。加強(qiáng)免疫后，各實(shí)驗(yàn)組小鼠脾細(xì)胞 IFN-γ分泌水平均高于加強(qiáng)免疫前的水平，而且V

11、LP-GM-CSF和VLP-CD40L免疫組小鼠脾細(xì)胞IFN-γ分泌水平明顯高于VLP免疫組。但各實(shí)驗(yàn)組小鼠脾細(xì)胞IL-4分泌水平均與生理鹽水對(duì)照組分泌水平相當(dāng)。各實(shí)驗(yàn)組小鼠CTL殺傷結(jié)果差異和脾細(xì)胞分泌的IFN-γ變化相一致。
　　免疫6個(gè)月后，對(duì)各實(shí)驗(yàn)組小鼠進(jìn)行HTNV攻擊。結(jié)果顯示，HTNV滅活疫苗組與生理鹽水對(duì)照組小鼠部分臟器內(nèi)檢測(cè)到較高水平的病毒抗原和核酸，病理切片觀察小鼠肝臟、腎臟和肺臟出現(xiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)等病理改變。經(jīng)HT

12、NV VLPs分別免疫的小鼠組織器官中病毒抗原和核酸含量均明顯低于生理鹽水對(duì)照組，且未見(jiàn)明顯的病理改變。表明HTNV VLPs分別免疫的小鼠均有效抵抗了病毒攻擊，而HTNV滅活疫苗免疫組小鼠不具有抵抗病毒攻擊的能力。加強(qiáng)免疫后，HTNV滅活疫苗免疫組和HTNV VLPs免疫組小鼠臟器中HTNV抗原和核酸載量均較生理鹽水對(duì)照組明顯降低，且臟器未見(jiàn)明顯病理改變，表明加強(qiáng)免疫后各實(shí)驗(yàn)組均具有良好的動(dòng)物保護(hù)作用。
　　【結(jié)論】
　　

13、本課題分別對(duì)前期構(gòu)建的三種 HTNV VLPs生物學(xué)活性及長(zhǎng)效免疫效果進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)HTNV VLPs分別在小鼠體內(nèi)、外的實(shí)驗(yàn)中發(fā)揮良好的生物學(xué)活性。在對(duì)其長(zhǎng)效免疫研究中發(fā)現(xiàn)，HTNV滅活疫苗免疫效果差，且?guī)缀鯖](méi)有動(dòng)物保護(hù)作用，需進(jìn)行加強(qiáng)免疫后才具有一定的免疫效果和動(dòng)物保護(hù)作用。HTNV VLPs分別具有長(zhǎng)效免疫效果，而且VLP-GM-CSF和VLP-CD40L與VLP相比表現(xiàn)出更好的免疫效果，加強(qiáng)免疫可以增強(qiáng)HTNV VLPs的免疫