重組埃博拉VLP疫苗制備及免疫效果初步研究.pdf

1、埃博拉病毒?。‥bola virus diseases，EVD）是由埃博拉病毒(Ebola virus)引起的一種高致病性的烈性傳染病。致病性最強(qiáng)的扎伊爾型埃博拉病毒（Zaire Ebola virus），致死率可高達(dá)90％。
　　埃博拉疫情的爆發(fā)對人類產(chǎn)生極大的威脅，但目前仍沒有上市的埃博拉疫苗。病毒載體與埃博拉病毒保護(hù)性抗原GP蛋白重組的疫苗，如重組水泡口腔炎病毒（VSV）疫苗、重組腺病毒（rADv3，rADv5）疫苗等在靈長

2、類動物中以誘導(dǎo)有效的免疫應(yīng)答走在前面，而且已完成Ⅰ期臨床研究，有效解決了應(yīng)急需求，但它們均以活病毒為載體，存在潛在的安全性風(fēng)險(xiǎn)，距離正式批準(zhǔn)上市仍有一段路要走。
　　病毒樣顆粒疫苗（Virus-like particles,VLP）是一類具有病毒結(jié)構(gòu)，沒有病毒復(fù)制能力，較減毒疫苗和以病毒為載體的疫苗更加安全的疫苗種類。以病毒樣顆粒形成的疫苗抗原可有效激發(fā)免疫應(yīng)答和免疫保護(hù)效果，研發(fā)病毒樣顆粒疫苗已成為埃博拉疫苗發(fā)展的重要方向。

3、r>　　埃博拉病毒已被列為生物安全等級4級的病毒，應(yīng)用埃博拉病原體的操作受到嚴(yán)格的限制和規(guī)定。因此阻礙了疫苗研發(fā)及其致病機(jī)制研究。而近年發(fā)展起來的假病毒系統(tǒng)可以模擬埃博拉病毒感染宿主過程，無病毒的致病性，可在中和抗體等多方面替代病毒的使用，在低安全級別的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行操作，為埃博拉疫苗有效性評價(jià)提供了保證。
　　目前處于Ⅰ期臨床階段的埃博拉疫苗與現(xiàn)上市疫苗一樣，多為有針肌肉注射免疫，存在恐針感、交叉感染、斷針等弊端，抗原用量大、免疫保

4、護(hù)不全面現(xiàn)實(shí)問題。由此，在免疫接種策略上降低抗原用量、誘發(fā)全面免疫應(yīng)答與保護(hù)及無針無痛、簡便快速、安全高效已成為疫苗研發(fā)迫切解決的重大科學(xué)問題。隨著近年無針注射技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用，為發(fā)展無針皮內(nèi)免疫埃博拉疫苗提供了新思路。
　　本研究針對目前流行的扎伊爾型埃博拉病毒疫苗研發(fā)的現(xiàn)實(shí)需求，采用昆蟲表達(dá)系統(tǒng)制備ZEBOLA-VLP，通過無針皮內(nèi)、有針肌肉注射途徑分別免疫BALB/c小鼠，并制備重組扎伊爾型埃博拉假病毒用于中和抗體測定，其研

5、究簡要報(bào)告如下:
　　一、目的：
　　運(yùn)用Bac-to-Bac昆蟲表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)扎伊爾型埃博拉病毒 GP+VP40-VLP（ZEBOLA-VLP）疫苗，經(jīng)皮內(nèi)、肌肉途徑分別免疫小鼠，并以HIV骨架構(gòu)建扎伊爾型埃博拉病毒囊膜GP蛋白的假病毒，評價(jià)免疫效果，為研發(fā)ZEBOLA-VLP疫苗提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　二、方法：
　　1、重組 ZEBOLA-VLP抗原制備：首先通過 Vector NTI AdvanceⅡ系統(tǒng)對扎伊

6、爾型埃博拉病毒保護(hù)性抗原GP和VP40蛋白基因序列進(jìn)行優(yōu)化；采用基因重組構(gòu)建穿梭質(zhì)粒pFastBacDUAL-VP40-GP；將重組的ZBacmid-VP40-GP轉(zhuǎn)染昆蟲Sf9細(xì)胞獲取重組桿粒病毒，表達(dá)重組ZEBOLA-VLP抗原；進(jìn)一步超濾濃縮，蔗糖梯度離心純化制備ZEBOLA-VLP抗原；通過SDS-PAGE、Western blot和HPLC等方法對重組ZEBOLA-VLP抗原鑒定。
　　2、重組埃博拉假病毒系統(tǒng)構(gòu)建：以埃

7、博拉病毒GP基因?yàn)榘悬c(diǎn)，采用慢病毒骨架，合成埃博拉病毒表面囊膜結(jié)構(gòu)基因；借助輔助載體等表達(dá)埃博拉病毒的糖蛋白 GP；與HIV骨架包被，制備只能感染細(xì)胞和安全性良好的假病毒系統(tǒng)。為埃博拉疫苗評價(jià)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　3、重組ZEBOLA-VLP抗原免疫效果初步評價(jià)：取制備的重組ZEBOLA-VLP抗原1μg、3μg、10μg、30μg、50μg劑量組分別無針皮內(nèi)和有針肌肉免疫6-8周齡雌性BALB/c小鼠，間隔21日加強(qiáng)免疫一次，并用

8、等量的PBS作陰性對照，于免疫前、免疫后14日采血；采用重組扎伊爾型埃博拉假病毒及間接ELISA方法分別測定免疫小鼠血清中和抗體效價(jià)和特異性IgG抗體效價(jià)，評價(jià)重組ZEBOLA-VLP疫苗的免疫效果。
　　三、結(jié)果：
　　成功構(gòu)建扎伊爾型埃博拉 pFastBacDUAL-VP40-GP穿梭質(zhì)粒并在昆蟲細(xì)胞中獲得高效表達(dá)，經(jīng)30%和60%蔗糖梯度離心加S600柱層析獲得了95%純度的重組ZEBOLA-VLP候選疫苗抗原。制備的

9、ZEBOLA-VLP抗原經(jīng)SDS-PAGE、Western blot鑒定有目的蛋白，電鏡下觀察病毒顆粒結(jié)構(gòu)大小均一，HLPC測定重組ZEBOLA-VLP抗原純度達(dá)到95%；經(jīng)顯微觀察及假病毒滴定判定，成功包裝了穩(wěn)定性好、滴度高、安全的假病毒系統(tǒng)，可用于中和抗體效價(jià)檢測；免疫重組ZEBOLA-VLP疫苗各劑量組均可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生中和抗體，并存在劑量依賴關(guān)系；無針皮內(nèi)免疫小鼠10μg為注射最佳劑量，其刺激產(chǎn)生的特異性IgG抗體效價(jià)明顯高于其他

10、劑量組；相同劑量組比較，無針皮內(nèi)免疫效果均高于肌肉注射組。
　　四、結(jié)論：
　　1、率先在國內(nèi)針對當(dāng)前爆發(fā)的扎伊爾型埃博拉流行株成功研制出高純度重組ZEBOLA-GP+VP40 VLP疫苗，為防控埃博拉提供了新疫苗類型；
　　2、借助 HIV慢病毒并針對扎伊爾型埃博拉流行株成功制備出高滴度、穩(wěn)定性好、安全性高的重組埃博拉假病毒，為研發(fā)埃博拉疫苗的有效性評價(jià)提供了實(shí)驗(yàn)材料。
　　3、創(chuàng)新研發(fā)的低壓無針免疫重組ZEB