流感病毒為載體的重組FLU-RSV疫苗株構(gòu)建及免疫保護(hù)效果研究.pdf

1、研究背景:呼吸道傳染病至今仍然是世界上導(dǎo)致死亡的主要原因之一,而流感病毒(Influenza virus,FLU)和呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus,RSV)則是重要的呼吸道病原體。目前,流感已有安全有效的不同類型疫苗,為流感的防控提供了保證。而RSV由于自身免疫特性,至今沒有批準(zhǔn)使用的疫苗,為其防控提出了挑戰(zhàn)。RSV是嬰幼兒下呼吸道感染最重要的病原,也是造成老年人和免疫缺陷成人住院和肺炎死亡的重要

2、原因。據(jù)統(tǒng)計,6個月以內(nèi)的嬰幼兒因RSV感染導(dǎo)致住院達(dá)70％,2周歲以內(nèi)的兒童甚至高達(dá)99%。RSV因其致病范圍廣,病情高發(fā),且會引起嚴(yán)重的并發(fā)癥等,給人類健康和生命安全造成了嚴(yán)重威脅。
　　RSV屬副粘病毒科肺病毒屬的非節(jié)段性單股負(fù)鏈RNA病毒,含A、B兩個血清型。RSV基因組全長約15Kb,編碼10種主要蛋白,分別由三個跨膜蛋白(G、F和SH)、兩個基質(zhì)蛋白(M和M2)、三個核衣殼蛋白(N、P和L)及兩個非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1和N

3、S2)構(gòu)成,其中融合蛋白F(Fusion protein,F)和附著蛋白G(Attchment protein,G)是RSV激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體最重要的病毒蛋白。G蛋白易變異,并非感染和細(xì)胞融合所必須的;F蛋白能夠穩(wěn)定遺傳,單獨(dú)的F蛋白就可引起細(xì)胞融合病變。針對RSVF和G糖蛋白的全身性中和抗體能有效防止RSV再感染,因此RSVF和G蛋白已作為公認(rèn)的保護(hù)性抗原和毒力致病分子。
　　疫苗是控制傳染病最有效的手段之一。對于RSV而言

4、,20世紀(jì)60年代,FulginitiVA等研制的福爾馬林滅活疫苗(FI-RSV)由于誘發(fā)Th2型免疫過激導(dǎo)致2名兒童死亡和80%住院以失敗告終。目前RSV疫苗的研究主要集中在載體疫苗、減毒活疫苗、亞單位疫苗、DNA疫苗、VLP疫苗,已有多種疫苗類型正在研制,但至今無獲批的RSV疫苗可用。RSV疫苗的研究一直是國際社會關(guān)注的焦點(diǎn),從已有的研制中的RSV疫苗可見,注射免疫不能產(chǎn)生有效的粘膜和細(xì)胞免疫反應(yīng)且免疫保護(hù)效果受限、DNA疫苗存在潛

5、在安全性以及全長F、G蛋白疫苗存在潛在Th1/Th2失平衡等瓶頸問題亟待解決。近年來,隨著流感病毒反向遺傳學(xué)技術(shù)日亦成熟及流感病毒載體的自身優(yōu)勢,以流感病毒作為遞送系統(tǒng)成功研發(fā)的RSV疫苗候選株能夠產(chǎn)生雙重免疫保護(hù)效果,且安全性高、易于操作,具有廣闊的發(fā)展前景,有望為RSV疫苗研究提供新的思路。
　　研究目的:采用流感病毒反向遺傳學(xué)技術(shù)重配篩選出流感病毒為載體的重組FLU-RSV疫苗株;對重組FLU-RSV疫苗進(jìn)行全面的鑒定,進(jìn)而

6、免疫動物和攻毒,評價重組FLU-RSV疫苗的免疫原性和免疫保護(hù)性,為發(fā)展RSV疫苗和實(shí)現(xiàn)“一苗兩用”提供思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法和結(jié)果:
　　第一部分:流感病毒為載體的重組FLU-RSV疫苗株的構(gòu)建及鑒定
　　首先,采用免疫抗原生物信息學(xué)預(yù)測和文獻(xiàn)調(diào)研,篩選并確定RSVF保護(hù)性抗原表位F205-223(PIVNKQSCRI SNIETVIEF)和F255-278(SELLSLIN DMPITNDQKK LMSNNV)

7、,以及G保護(hù)性抗原表位G142-204(QPSKPTTKQR QNKPPNKPNN DFHFEVFNFV PCSICSNNPT CWAICKRIPN KKPGKKTTTK PTK)。F保護(hù)性抗原表位使用GPGLinker連接,并將F205-223-GPG-F255-278命名為F,G142-204命名為G。將RSV抗原表位F、G和F+G分別插入到流感病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1基因片段中,基因NS1-F、NS1-G和NS1-F+G分別與雙向轉(zhuǎn)錄

8、表達(dá)載體pHW2000通過BSmBⅠ酶切、切膠回收、目的質(zhì)粒與pHW2000載體連接、轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)及菌液PCR等構(gòu)建重組質(zhì)粒。當(dāng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)陽性條帶、菌液送生工測序與預(yù)期序列吻合,表明重組質(zhì)粒NS1-F、NS1-G和NS1-F+G構(gòu)建成功。
　　重組質(zhì)粒NS1-F、NS1-G和NS1-F+G分別與已構(gòu)建的流感病毒7質(zhì)粒PB2、PB1、PA、HA、NP、NA和M通過“7+1”組合,采用Effectene將流

9、感病毒8質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染COS-1/MDCK細(xì)胞,其中以重組質(zhì)粒代替NS質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染;24h后將6孔板中的培養(yǎng)基換成0.8μg/mLTPCK胰酶的無血清DMEM培養(yǎng)液;48h后吸取上清進(jìn)行血凝初檢。當(dāng)發(fā)現(xiàn)血凝陽性結(jié)果,將該孔的細(xì)胞及上清接種9日齡SPF雞胚。3天后吸取尿囊液,進(jìn)行血凝復(fù)檢,結(jié)果顯示陽性。重組FLU-RSV疫苗病毒液接種雞胚,連傳3代能穩(wěn)定遺傳,表明重組FLU-RSV疫苗株重配成功,我們將其分別命名為rFLU/RSV/F、rFL

10、U/RSV/G和rFLU/RSV/F+G。
　　重配成功的重組FLU-RSV疫苗病毒株經(jīng)接種雞胚擴(kuò)增、30KD超濾膜包濃縮、30%-60%蔗糖密度梯度純化,測定其血凝效價和CCID50病毒滴度。Westernblot檢測成功表達(dá)RSV特異性的蛋白,電鏡觀察發(fā)現(xiàn)重組FLU-RSV疫苗病毒株的大小分布及粒子結(jié)構(gòu)符合流感病毒的形態(tài)特征,細(xì)胞培養(yǎng)顯示重組FLU-RSV病毒可在MDCK、A549和CNE-2Z細(xì)胞有效復(fù)制。以上結(jié)果表明,成功

11、重配了流感病毒為載體的重組FLU-RSV疫苗株。
　　第二部分:流感病毒為載體的重組FLU-RSV疫苗免疫原性和免疫保護(hù)效果評價
　　選用6周齡的雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為7組,每組30只。采用上述成功重配的rFLU/RSV/F、rFLU/RSV/G和rFLU/RSV/F+G疫苗株為實(shí)驗(yàn)組,同時設(shè)立104CCID50和105CCID50兩個劑量組,并用0.01MPBS為對照組。小鼠按上述劑量進(jìn)行滴鼻免疫,20μL/只。0天

12、、28天免疫,共2次。免疫前、初免后4周和二免(加強(qiáng)免疫)后2周收集小鼠血清、肺鼻灌洗液及脾淋巴細(xì)胞懸液。取免疫小鼠血清測定針對流感病毒和RSV的中和抗體效價和針對RSV的IgG類抗體及亞型IgG1和IgG2a的滴度,用于評價重組FLU-RSV疫苗株的免疫原性;取小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液測定針對RSV的細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IL-5、IFN-γ和TNF-α,用于評價Th1/Th2系統(tǒng)免疫應(yīng)答平衡;取小鼠肺鼻灌洗液測定RSV特異性的抗體s

13、IgA效價,用于評價重組FLU-RSV疫苗株的粘膜免疫應(yīng)答。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,rFLU/RSV/F、rFLU/RSV/G和rFLU/RSV/F+G疫苗株在小鼠體內(nèi)能夠產(chǎn)生針對流感病毒和RSV的中和抗體,產(chǎn)生針對RSV的Th1型細(xì)胞免疫反應(yīng)及粘膜免疫反應(yīng),且Th1/Th2免疫應(yīng)答平衡,而PBS對照組陰性。同時,rFLU/RSV/F+G疫苗株的免疫原性優(yōu)于rFLU/RSV/F和rFLU/RSV/G。由此初步推斷,rFLU/RSV/F+G疫苗株是

14、最有潛力的RSV候選疫苗株。
　　采用加強(qiáng)免疫2周后的各組小鼠,每組20只,分別用當(dāng)前流行病毒株,即PR8流感病毒野生株(100LD50)和RSVA2株(2×106PFU/mL)對小鼠進(jìn)行滴鼻攻毒,連續(xù)2周記錄小鼠病毒攻擊后的體重變化及存活情況。PR8流感病毒攻毒第四天測定小鼠肺和鼻甲骨組織的病毒載量,HE染色觀察肺病理變化;RSVA2株攻毒第六天測定小鼠肺和鼻甲骨組織的病毒載量,HE染色觀察肺病理變化,并計數(shù)小鼠支氣管肺泡灌洗液

15、中的炎性細(xì)胞總量及各個炎性細(xì)胞數(shù)量,主要包括嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、小單核細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。攻毒結(jié)果顯示,rFLU/RSV/F、rFLU/RSV/G和rFLU/RSV/F+G疫苗株能對免疫小鼠產(chǎn)生有效的免疫保護(hù)效果,且免疫保護(hù)效率提示rFLU/RSV/F+G>rFLU/RSV/F>rFLU/RSV/G,進(jìn)一步表明rFLU/RSV/F+G疫苗株具有顯著地免疫原性和免疫保護(hù)效果,能有效提高機(jī)體的體液、細(xì)胞及粘膜免疫應(yīng)答,是最有

16、潛力的流感病毒為載體的RSV疫苗候選株。
　　結(jié)論:通過反向遺傳學(xué)技術(shù)成功重配篩選出以流感病毒為載體的重組FLU-RSV疫苗株。鑒定結(jié)果顯示rFLU/RSV/F、rFLU/RSV/G和rFLU/RSV/F+G疫苗株可在MDCK、A549和CNE-2Z細(xì)胞有效復(fù)制、重組病毒形態(tài)與流感病毒相符且表達(dá)RSV特異性的保護(hù)性抗原蛋白。免疫原性評價結(jié)果顯示,重組FLU-RSV疫苗在小鼠體內(nèi)能夠產(chǎn)生針對流感病毒和RSV的中和抗體,產(chǎn)生針對RSV