乙腦病毒非結(jié)構(gòu)4A蛋白編碼基因重組構(gòu)建與表達(dá).pdf

1、目的：
　　 構(gòu)建乙腦病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）非結(jié)構(gòu)（non-structure，NS）4A蛋白編碼基因重組子，將其轉(zhuǎn)染中華倉(cāng)鼠卵巢（Chinese hamster ovary，CHO）細(xì)胞并用間接免疫熒光法探討該重組子的表達(dá)特征，為進(jìn)一步研究JEV NS4A蛋白的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。
　　 材料與方法：
　　 一、實(shí)驗(yàn)材料
　　 （一）細(xì)胞、質(zhì)粒及菌株

2、>　　 CHO細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)研究院上海細(xì)胞庫(kù)，生長(zhǎng)于37℃，5％CO2及含10％胎牛血清（Fatal calf serum，F(xiàn)CS）的Dulbecco’modified eagle medium（DMEM）高糖培養(yǎng)液中；含F(xiàn)LAG片段的JEV NS4A蛋白編碼基因重組質(zhì)粒被命名為pJNS4A由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建；真核表達(dá)載體pcDNA3.1（+）購(gòu)自Invitrogen公司，用于JEV NS4A蛋白編碼基因重組子的構(gòu)建；大腸桿菌JM109

3、與DH5α購(gòu)自Takara公司，用于重組質(zhì)粒構(gòu)建、轉(zhuǎn)化。
　　 （二）試劑及抗體
　　 RNA抽提試劑（Code No.D312），RT-PCR試劑盒（Code No.DR027A），DNA片斷純化試劑盒（Takara，product No.DV807），DNA A尾試劑盒（Takara，product No.D404），瓊脂糖凝膠DNA純化試劑盒（Takara，product No.DV805），DNA連接試劑盒（Ta

4、kara，product No.D6023），質(zhì)粒小劑量提取試劑盒（Takara，product No.DV801A），限制性內(nèi)切酶EcoRI、BamHI均購(gòu)自Takara公司，用于重組質(zhì)粒的構(gòu)建和酶切鑒定。脂質(zhì)體（Lipofectamine 2000）購(gòu)自Invitrogen公司，用于轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞。氨芐青霉素購(gòu)自Sigma公司，瓊脂糖購(gòu)自Takara公司，用于質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化和電泳分析；DMEM高糖培養(yǎng)液，10％FCS，青霉素購(gòu)自海科隆公

5、司，用于CHO細(xì)胞的培養(yǎng)；兔抗鼠IgG Fc（一抗），購(gòu)自Cell Signaling公司，山羊抗兔（熒光二抗）購(gòu)自北京中杉金橋公司，用于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的免疫熒光檢測(cè)。
　　 二、實(shí)驗(yàn)方法
　　 （一）JEV NS4A蛋白編碼基因重組質(zhì)粒構(gòu)建與鑒定
　　 以JEV SA14-14-2株Total RNA為模板，運(yùn)用RT-PCR方法擴(kuò)增JEVNS4A基因片段，并在該基因片段的5’端加入FLAG序列，再在其兩側(cè)加入起始密

6、碼子與終止密碼子，最后在其兩側(cè)加入BamHI/EcoRI酶切位點(diǎn)。將反轉(zhuǎn)錄引物：5’GAATTCTTAGGCTCCTGCACAAGCT ATGAC3’及限制性內(nèi)切酶EcoRI（-GAA TTC-）合成至JEV NS4A編碼基因5’末端。PCR法擴(kuò)增前向引物5’GGATCCATGACTAAAAAACCAGGAGGGC3’，將BamHI（-GGA TCC-）合成至5’末端，反向引物為上述反轉(zhuǎn)錄引物。1％瓊脂糖凝膠電泳并回收最終PCR產(chǎn)物，后

7、者與pMD19-T simple連接構(gòu)建重組子pMD-JNS4A。使用PrimeSTAR@HS DNA Polymerase（CodeNo.DR0-10S），對(duì)重組質(zhì)粒CTB756-T-7為模板，以CTB906F（5’CGGGATCCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAGATGTCAGCCGTTAG CTTCATAG3’）為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用TaKaRa Agarose Gel DNAPurific

8、ation Kit Vet.2.0（Code No.DV805A）進(jìn)行切膠回收約900bp的片段后，使用BamHI/EcoRI進(jìn)行酶切，經(jīng)乙醇沉淀后，命名為Insert DNA； 將質(zhì)粒pcDNA3.1（+）使用BamHI/EcoRI進(jìn)行酶切，然后使用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0（Code--No.DV805A）切膠回收約5.4kbp的DNA片段后，命名為Vector D

9、NA；使用TaKaRa DNA Ligation Kit（Code No.D6022）中的Solution Ⅰ將Insert DNA和Vector DNA連接后，熱轉(zhuǎn)化至E.coli Competent Cell JM109（Code No.D9052）中，涂布平板，37℃過(guò)夜培養(yǎng)。挑選陽(yáng)性菌落植菌，提取質(zhì)粒命名為CTB906-2，使用引物T7、BGHrev對(duì)上述質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果正確。轉(zhuǎn)化pJNS4A于大腸桿菌DH5α，小劑量提取質(zhì)粒

10、pJNS4A，并用BamHI/EcoRI酶切進(jìn)行核酸電泳鑒定。
　　 （二）pJNS4A穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞
　　 采用脂質(zhì)體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染法即Lipofectamine 2000將pJNS4A轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，同時(shí)設(shè)轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1（+）的CHO細(xì)胞與未轉(zhuǎn)染的正常CHO細(xì)胞為陰性對(duì)照。
　　 具體方法為：
　　 1、轉(zhuǎn)染
　　 實(shí)驗(yàn)前在6孔板中培養(yǎng)CHO細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)濃度約90％-95％，即每

11、500ul含0.5-2.0×105/個(gè)。配制脂質(zhì)體/質(zhì)?；旌衔铮喝芤篈、B：分別將重組質(zhì)粒pJNS4A和空載體pcDNA3.1（+）各8μg（每孔）加入DMEM培養(yǎng)液（不含胎牛血清）500ul中，溶液總體積各為250μl（每孔），輕輕混勻，標(biāo)記；溶液C：將20μl脂質(zhì)體加入500μl DMEM培養(yǎng)液中，共四管，輕輕混勻，室溫孵育5分鐘；分別將A與C，B與C液體混合，室溫放置20分鐘（這時(shí)溶液會(huì)變渾濁）以形成脂質(zhì)體/質(zhì)?；旌衔铮粭壢?孔板

12、中的原液，向6孔板中逐滴加入上述混合液體，邊加邊搖動(dòng)培養(yǎng)板，每孔2ml，做標(biāo)記。在37℃，5％的CO2中培養(yǎng)4小時(shí)后，改用無(wú)血清無(wú)抗生素的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。
　　 2、篩選
　　 6孔板培養(yǎng)24小時(shí)后，改為24孔板繼續(xù)培養(yǎng)。用含G418濃度依次為100、150、200，250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900ug/mL的DMEM培養(yǎng)。每種濃度設(shè)3

13、個(gè)孔，轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的CHO細(xì)胞及正常CHO細(xì)胞為對(duì)陰性照組。培養(yǎng)15 d后，以能殺死所有正常CHO細(xì)胞的最低G418的濃度作為本實(shí)驗(yàn)的最佳篩選濃度即為100 ug/m L，維持培養(yǎng)。
　　 （三）免疫熒光檢測(cè)
　　 將轉(zhuǎn)染pJNS4A的CHO細(xì)胞、轉(zhuǎn)染空載體的CHO細(xì)胞及正常的CHO細(xì)胞接種于6孔板中的蓋玻片，以蓋滿玻片不溢出為度，標(biāo)記。于37℃，5％CO2的條件下常規(guī)培養(yǎng)待細(xì)胞密度達(dá)到約60％-70％時(shí)，4％多聚甲醛固定

14、細(xì)胞1 h，0.1％Triton X.100打孔10 min，10％BSA封閉1 h，兔抗鼠IgG Fc分別按1:800稀釋，4℃孵育過(guò)夜。FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG按1:00稀釋濃度，于37℃避光孵育1 h，50％甘油封片后于熒光顯微鏡下觀察熒光標(biāo)記。
　　 結(jié) 果
　　 1、JEV NS4A蛋白編碼基因構(gòu)建
　　 （1）以JEV SA14-14-2株Total RNA為模板，經(jīng)重組構(gòu)建含有FLAG片段的JEV

15、 NS4A 蛋白編碼基因重組子pJNS4A。經(jīng)酶切鑒定表明：重組質(zhì)粒經(jīng)BamHI/EcoRI酶切釋出的插入子與pJNS4A經(jīng)相同酶切釋出插入子的分子量大小相一致，均約為900bps，使用引物T7、BGHrev對(duì)上述質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，含有JEV NS4A蛋白編碼基因片段，證明質(zhì)粒構(gòu)建成功。
　　 （2）將pJNS4A在感受態(tài)大腸桿菌中擴(kuò)增，提取質(zhì)粒RNA，行核酸電泳對(duì)其鑒定?？梢?jiàn)在約900bps的位置上有一明顯條帶，證明質(zhì)粒構(gòu)建成功。

16、
　　 2、JEV NS4A蛋白編碼基因重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞免疫熒光鑒定
　　 轉(zhuǎn)染pJNS4A的CHO細(xì)胞可見(jiàn)存在較顯著綠色熒光標(biāo)記，主要分布在胞膜。在正常CHO細(xì)胞及轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的CHO細(xì)胞中未見(jiàn)特異性綠色熒光標(biāo)記，僅見(jiàn)散在的非特異性綠色熒光雜質(zhì)。
　　 結(jié)論：
　　 1、構(gòu)建的重組子pJNS4A含有JEV NS4A編碼基因。
　　 2、轉(zhuǎn)染了重組子pJNS4A的CHO細(xì)胞能夠穩(wěn)定表達(dá)JEV