Notch蛋白通過調(diào)節(jié)JAK-STAT通路促進(jìn)心臟瓣膜間質(zhì)細(xì)胞分泌BMPS加速瓣膜鈣化.pdf

1、研究背景：
　　隨著社會(huì)老齡化加劇，以及檢查手段的不斷豐富，鈣化性心臟瓣膜病的發(fā)病率顯著增高，也越來(lái)越增加了人們的關(guān)注。實(shí)際上，鈣化性瓣膜疾病早期并無(wú)明顯臨床表現(xiàn)，但隨著疾病的發(fā)生發(fā)展會(huì)出現(xiàn)較為嚴(yán)重的并發(fā)癥，甚至可以危及生命。到目前為止，仍然沒有有效的藥物及手段來(lái)干預(yù)鈣化性瓣膜病的進(jìn)展，主要原因就是對(duì)瓣膜鈣化的發(fā)病機(jī)制并不十分明確。心臟瓣膜鈣化的實(shí)質(zhì)是瓣膜結(jié)締組織結(jié)構(gòu)發(fā)生纖維化及退行性變，使瓣膜變硬、增厚、變形及磷酸鹽沉積，導(dǎo)致瓣

2、膜的狹窄和(或)關(guān)閉不全，嚴(yán)重影響瓣膜的正常功能，甚至危及患者生命?，F(xiàn)有研究表明瓣膜鈣化可能與慢性感染及自身免疫有關(guān)，但仍然存在著很多爭(zhēng)論，由于建立理想的體外瓣膜鈣化研究模型比較困難，一定程度上也限制了對(duì)瓣膜鈣化的發(fā)生機(jī)制的研究。
　　心臟瓣膜由瓣膜內(nèi)皮細(xì)胞(VECs)、瓣膜間質(zhì)細(xì)胞(VICs)和細(xì)胞外基質(zhì)，包括膠原蛋白，彈性蛋白和糖胺聚糖所組成。主動(dòng)脈瓣膜分為三層結(jié)構(gòu)：纖維層，松質(zhì)層和室肌層。纖維層靠近流出道，由膠原蛋白組成，為

3、瓣膜提供強(qiáng)度；室肌層靠近心室肌，富有彈性；松質(zhì)層是中心層，主要由多糖構(gòu)成的疏松結(jié)締組織。瓣膜內(nèi)皮細(xì)胞排列在與血液接觸的瓣膜表面。瓣膜間質(zhì)細(xì)胞則是形成瓣膜結(jié)構(gòu)的骨架，參與瓣膜鈣化全過程。手術(shù)切除下來(lái)的鈣化瓣膜組織研究發(fā)現(xiàn)，瓣膜中有成骨樣細(xì)胞的形成，BMP-2、BMP-4的表達(dá)明顯增加。因此，目前認(rèn)為成骨相關(guān)蛋白的積累，是瓣膜鈣化導(dǎo)致功能障礙的主要發(fā)病機(jī)制之一。心臟瓣膜中起主要生理作用的是瓣膜間質(zhì)細(xì)胞，瓣膜間質(zhì)細(xì)胞表型改變也是促進(jìn)瓣膜鈣化的

4、重要因素，抑制瓣膜間質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變，維持瓣膜間質(zhì)細(xì)胞處于靜止表型可以明顯的減少鈣化。
　　Notch蛋白為一種跨膜蛋白受體，人體有4種Notch受體（即Notch1-4）和5種Notch配體（Delta-like1,3,4，Jagged1和Jagged2）。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，Notch信號(hào)是T淋巴細(xì)胞發(fā)育所必須，參與人體免疫應(yīng)答的多個(gè)環(huán)節(jié)。細(xì)菌脂多糖(LPS)可以誘導(dǎo)Notch蛋白與其相應(yīng)配體結(jié)合，在γ-內(nèi)分泌酶的作用下經(jīng)過剪切形成其

5、活性形式NICD，由胞內(nèi)段釋放入胞質(zhì)，NICD在胞質(zhì)內(nèi)可以激活NF-κB、ERK、JAK-STAT等多條細(xì)胞炎癥相關(guān)信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞分泌IL-1、IL-6、IL-8、TNF-β等多種炎性因子，參與心臟瓣膜的炎癥反應(yīng)。同時(shí)，NICD可以通過RAM結(jié)構(gòu)域和cdc/ankyrin重復(fù)序與CSL蛋白相結(jié)合，并募集核轉(zhuǎn)錄激活蛋白家族MAML，形成NICD-CSL-MAML轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合體，從而激活HES、HERP、HEY等轉(zhuǎn)錄抑制因子家族的靶基因

6、，募集組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶，使組蛋白乙酰化抑制基因轉(zhuǎn)錄；另一方面，NICD可以激活瓣膜間質(zhì)細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)，最終活化Caspase酶，從而引起瓣膜間質(zhì)細(xì)胞的凋亡。
　　JAK-STAT即一種非受體型酪氨酸蛋白激酶，JAK即Janus Kinase，STAT即Signal transducers and activators of transcription（信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子），現(xiàn)在已克隆成功4種JAK(JAK1-3和Ty

7、k2)與6種STAT(Stat1-6)。配體誘發(fā)相應(yīng)受體形成二聚體后發(fā)生自身酪氨酸磷酸化而激活，激活后STAT進(jìn)入細(xì)胞核，與DNA模塊上的特異蛋白結(jié)合，誘導(dǎo)目標(biāo)mRNA的產(chǎn)生，最后轉(zhuǎn)錄、生成和釋放各種目標(biāo)產(chǎn)物[46]。JAK-STAT參與了體內(nèi)炎癥反應(yīng)及細(xì)胞增殖的過程。我們推斷JAK-STAT在瓣膜間質(zhì)細(xì)胞的鈣化中起一定的作用。
　　本研究中我們采用β-甘油磷酸、抗壞血酸、地塞米松、重組型人BMP-2等因素干預(yù)，建立體外人心臟瓣膜

8、間質(zhì)細(xì)胞的鈣化模型，假想鈣化的瓣膜間質(zhì)細(xì)胞表面Notch2表達(dá)高于正常瓣膜間質(zhì)細(xì)胞，通過Notch2信號(hào)通路與JAK-STAT信號(hào)通路發(fā)生交互作用，促進(jìn)瓣膜間質(zhì)細(xì)胞分泌BMP-2/4，誘導(dǎo)瓣膜間質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，從而加速瓣膜的鈣化進(jìn)程。因此本研究為鈣化性主動(dòng)脈瓣疾病的發(fā)病機(jī)制及治療提供了理論依據(jù)。本研究中我們首先建立人心臟瓣膜間質(zhì)細(xì)胞的鈣化模型，通過加強(qiáng)Notch2表達(dá)與抑制其表達(dá)，探討對(duì)下游通路的調(diào)節(jié)作用，本研究共分為三部分進(jìn)行。

9、>　　第一部分心臟瓣膜間質(zhì)細(xì)胞體外鈣化模型的建立
　　目的：
　　通過體外培養(yǎng)人瓣膜間質(zhì)細(xì)胞，采用β-甘油磷酸、抗壞血酸、地塞米松、重組型人BMP-2等因素干預(yù)，建立體外瓣膜間質(zhì)細(xì)胞的鈣化模型，探討B(tài)MP-2與鈣化瓣膜間質(zhì)細(xì)胞之間的相關(guān)性，旨在尋找干預(yù)鈣化的新靶點(diǎn)，為延緩瓣膜鈣化進(jìn)程提供了新的方向。
　　方法：
　　取傳4代的hVIC以1×105/ml的密度種植于兩塊6孔板內(nèi)，分為兩組，每組6孔，對(duì)照組中加入細(xì)胞

10、培養(yǎng)液、10％胎牛血清以及60ng/ml重組型人BMP-2蛋白(2μl)；實(shí)驗(yàn)組中加入培養(yǎng)液、10%胎牛血清以及60ng/ml重組型人BMP-2蛋白(2μl)，100nmol/L地塞米松加入80μl，80μg/ml L-抗壞血酸加入120μl，6mmol/Lβ-甘油磷酸加入300μl，培養(yǎng)14天。Von Kossa染色體現(xiàn)細(xì)胞鈣化情況，Western-Blot檢測(cè)細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)、白細(xì)胞介素-8(IL-8)、BMP-2

11、/4蛋白表達(dá)， ELISA方法檢測(cè)培養(yǎng)液上清BMP-2蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　培養(yǎng)14天的實(shí)驗(yàn)組hVIC行Von Kossa染色，可見細(xì)胞可形成大小不等的結(jié)節(jié)，胞質(zhì)內(nèi)沉積物與細(xì)胞內(nèi)結(jié)節(jié)被染成黑色，顯示有鈣質(zhì)沉積；而對(duì)照組hVIC行Von Kossa染色，細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)較為清晰，胞質(zhì)內(nèi)及細(xì)胞周圍僅有數(shù)個(gè)非特異性黑色顆粒。實(shí)驗(yàn)組可見有每孔鈣化節(jié)結(jié)(57±7)；對(duì)照組可見有每孔鈣化節(jié)結(jié)(10±3)，實(shí)驗(yàn)組的鈣化節(jié)結(jié)多于對(duì)照組，

12、兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.03)。實(shí)驗(yàn)組hVIC中炎癥因子(ICAM-1、IL-8)及鈣化相關(guān)因子(BMP-2、BMP-4)的表達(dá)較對(duì)照組均升高。實(shí)驗(yàn)組hVIC培養(yǎng)液上清中BMP-2表達(dá)水平為(92.49±4.92pg/ml)，明顯高于對(duì)照組hVIC培養(yǎng)液上清中BMP-2表達(dá)水平(22.22±1.88pg/ml)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.02)。
　　第二部分Notch蛋白的活化及心臟瓣膜間質(zhì)細(xì)胞的炎性反應(yīng)
　　目的：

13、
　　細(xì)菌脂多糖(LPS)可以誘導(dǎo)Notch蛋白與其相應(yīng)配體結(jié)合，在γ-內(nèi)分泌酶的作用下經(jīng)過剪切形成其活性形式NICD，可以誘導(dǎo)瓣膜間質(zhì)細(xì)胞炎性反應(yīng)，使其發(fā)生表型轉(zhuǎn)變，加速瓣膜鈣化。通過對(duì)比鈣化的瓣膜間質(zhì)細(xì)胞與正常的瓣膜間質(zhì)細(xì)胞Notch蛋白的表達(dá)，明確瓣膜炎性反應(yīng)與瓣膜鈣化之間的聯(lián)系。
　　方法：
　　取第一部分實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)鈣化的hVIC以1×105/ml的密度種植于兩塊6孔板內(nèi)分為兩組，每組6孔，對(duì)照組中加入細(xì)胞培養(yǎng)液

14、；實(shí)驗(yàn)組中加入等量的細(xì)胞培養(yǎng)液外同時(shí)加入 LPS0.2μg/ml（即4μl/孔）刺激12小時(shí)以活化 Notch蛋白。Western-Blot方法來(lái)檢測(cè)Notch蛋白的活化，免疫熒光方法來(lái)檢測(cè)Notch蛋白的表達(dá)，Von Kossa染色體現(xiàn)細(xì)胞鈣化情況；取正常hVIC以1×105/ml的密度種植于6孔板內(nèi)為對(duì)照組；取第一部分實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)鈣化的hVIC為實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)向兩組hVIC內(nèi)加入LPS0.2μg/ml（即4μl/孔）刺激12小時(shí)以活化No

15、tch蛋白。Western-Blo方法來(lái)檢測(cè)BMP-2蛋白表達(dá)，ELISA方法檢測(cè)培養(yǎng)液上清BMP-2蛋白的表達(dá)
　　結(jié)果：
　　實(shí)驗(yàn)組hVIC中Notch2、DLL4、NICD蛋白的表達(dá)較對(duì)照組均升高。免疫熒光結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組 hVIC細(xì)胞表面 Notch2蛋白的表達(dá)明顯高于對(duì)照組。Von Kossa染色實(shí)驗(yàn)組可見有每孔鈣化節(jié)結(jié)(45±3)；對(duì)照組可見有每孔鈣化節(jié)結(jié)(10±2)，實(shí)驗(yàn)組的鈣化節(jié)結(jié)多于對(duì)照組，兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

16、義(P＜0.04)。實(shí)驗(yàn)組hVIC中Notch2、BMP-2蛋白的表達(dá)較對(duì)照組均升高。實(shí)驗(yàn)組hVIC培養(yǎng)液上清中BMP-2表達(dá)水平為(69.74±2.32pg/ml)，明顯高于對(duì)照組hVIC培養(yǎng)液上清中BMP-2表達(dá)水平(31.02±1.68pg/ml)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.03)。
　　第三部分 Notch蛋白通過調(diào)節(jié)JAK-STAT通路促進(jìn)心臟瓣膜間質(zhì)細(xì)胞分泌BMPS加速瓣膜鈣化
　　目的：
　　Notch信

17、號(hào)通路與JAK-STAT信號(hào)通路交互作用參與了瓣膜間質(zhì)細(xì)胞向成骨樣分化的過程，參與瓣膜間質(zhì)細(xì)胞鈣化。抑制Notch蛋白活化或抑制Notch信號(hào)下游通路激活，可以延緩瓣膜鈣化的進(jìn)程，為臨床治療瓣膜鈣化性疾病提供新的靶點(diǎn)與依據(jù)。
　　方法：
　　取第一部分實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)鈣化的hVIC以1×105/ml的密度種植于兩塊6孔板內(nèi)，分為兩組，每組6孔，分別向兩組hVIC內(nèi)加入LPS0.2μg/ml（即4μl/孔）刺激12小時(shí)以活化Notch

18、蛋白，實(shí)驗(yàn)組hVIC內(nèi)加入Notch蛋白特異性抑制劑DAPT50μmol/L（即4μl/孔），對(duì)照組hVIC不做處理，Western-Blot檢測(cè)BMP-2/4蛋白表達(dá)及JAK-STAT磷酸化水平，ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)液上清中的BMP-2蛋白表達(dá)，Von Kossa染色體現(xiàn)細(xì)胞鈣化情況；向兩塊6孔板內(nèi)hVIC內(nèi)加入LPS0.2μg/ml（即4μl/孔），刺激1h、2h、4h、8h、12h后用Western-Blot分別檢測(cè)JAK-STA

19、T磷酸化水平；實(shí)驗(yàn)組 hVIC內(nèi)加入 JAK-STAT磷酸化特異性抑制劑 GLPG0634(10μg/ml)；對(duì)照組中加入等量細(xì)胞培養(yǎng)液，Western-Blot檢測(cè)BMP-2/4蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　實(shí)驗(yàn)組hVIC中BMP-2/4蛋白的表達(dá)較對(duì)照組均降低。實(shí)驗(yàn)組hVIC培養(yǎng)液上清中BMP-2表達(dá)水平為(28.94±2.28pg/ml)，明顯低于對(duì)照組hVIC培養(yǎng)液上清中BMP-2表達(dá)水平(79.44±2.93pg/m

20、l)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.02)。Von Kossa染色實(shí)驗(yàn)組可見有每孔鈣化節(jié)結(jié)(12±3)；對(duì)照組可見有每孔鈣化節(jié)結(jié)(30±2)，實(shí)驗(yàn)組的鈣化節(jié)結(jié)數(shù)明顯少于對(duì)照組，兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。LPS刺激hVIC1h、2h、4h、8h和12h，這5組不同的實(shí)驗(yàn)證實(shí)Notch2可以使JAK-STAT磷酸化并延遲其降解的時(shí)間，其中刺激4h(P＜0.05)和8h(P＜0.02)JAK-STAT磷酸化有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)