JAK-STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在脊髓損傷中的作用研究.pdf

1、脊髓損傷(SCI)多發(fā)于20-40歲中青年人群。SCI嚴(yán)重影響患者的運(yùn)動(dòng)功能。SCI引起了一系列細(xì)胞因子介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，包括腫瘤壞死因子(TNF-a)、白介素-6(IL-6)、IL-β等，并且這些因子導(dǎo)致二次損傷。以前的研究表明:SCI后TNF-a、IL-6、IL-β等的mRNA基因表達(dá)顯著上調(diào)。酪氨酸激酶(JAK)及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)信號(hào)通路的激活是信號(hào)從細(xì)胞表面?zhèn)鞯郊?xì)胞核的重要途徑，細(xì)胞膜JAK激活導(dǎo)致STAT在細(xì)胞

2、質(zhì)磷酸化，信號(hào)由磷酸化的STAT傳導(dǎo)至細(xì)胞核，接著靶基因轉(zhuǎn)位，這在SCI后病理生理變化起重要的作用。
　　STAT信號(hào)通路在周圍神經(jīng)損傷的作用已被廣泛研究，在小鼠面神經(jīng)，舌下神經(jīng)損傷后再生研究中，使用原位雜交技術(shù)及半定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)發(fā)現(xiàn):JAK1、JAK2、JAK3、STAT1、STAT3、STAT5的mRNA短暫增加，只有STAT3顯著增加并持續(xù)。周圍神經(jīng)損傷同時(shí)激活脊髓背側(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞的JAK/STAT通路。在SCI研究中，

3、SCI后STAT3信號(hào)通路在星形膠質(zhì)細(xì)胞增生及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘢痕形成過(guò)程中起重要的作用。Okada et al證實(shí):在SCI后運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)及損傷組織修復(fù)過(guò)程中，STAT3在調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性中起關(guān)鍵作用。免疫印跡表明:SCI后6小時(shí)各種細(xì)胞的JAK1/STAT3通路被顯著激活，在急性期，神經(jīng)元的STAT3磷酸化有助于SCI后的神經(jīng)保護(hù)，而在慢性階段則是小膠質(zhì)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞STAT3磷酸化而激活。
　　研究表明“STAT1與脊

4、髓神經(jīng)元的死亡，脊髓局部缺血等密切相關(guān)，但其機(jī)制仍未完全明確。脊髓損傷可由原發(fā)性和繼發(fā)性因素共同引起，嚴(yán)重?fù)p害患者的生活質(zhì)量。在原發(fā)性脊髓損傷中，在很短的時(shí)間內(nèi)脊髓發(fā)生不可逆性損傷，而繼發(fā)性脊髓損傷則涉及一系列的病理改變，包括局灶性組織缺血，水腫和炎癥。在心肌缺血再灌注損傷中，發(fā)現(xiàn)STAT1激活引起細(xì)胞凋亡，而且STAT1在大腦缺血后被激活，引起大腦缺血性損傷。其機(jī)制是抑制PI3-激酶/AKT通路的神經(jīng)保護(hù)作用并使凋亡受體Fas表達(dá)增加

5、。自由基清除劑及抗氧化劑保護(hù)心肌細(xì)胞及腦組織，對(duì)抗缺血再灌注損傷的機(jī)制是:自由基清除劑及抗氧化劑有效抑制STAT1的磷酸化，STAT1缺失大鼠表現(xiàn)出大腦缺血體積的減少，而且STAT1缺失的細(xì)胞能夠抵抗TNF-a或IL-β介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，依據(jù)這些研究結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)提出神經(jīng)凋亡可能由于SCI后STAT1的激活引起。
　　氧化損傷是許多疾病的病因，包括:帕金森病、老年癡呆癥、脊髓側(cè)索硬化癥等，這些氧化應(yīng)激伴隨著JAK/STAT通路的激活，

6、也有報(bào)道在蛛網(wǎng)膜下腔出血時(shí)氧化應(yīng)激伴隨著STAT1的激活，這些研究表明JAK1/STAT1信號(hào)通路可能誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)并與SCI后神經(jīng)元死亡有關(guān)。在腦缺血后神經(jīng)元JAK1/STAT3信號(hào)通路被激活，STAT3通過(guò)神經(jīng)保護(hù)基因bcl-2在神經(jīng)保護(hù)中起重要作用，抑制STAT3可以增加腦梗死的面積。前期研究提示:抑制白介素-6導(dǎo)致STAT3磷酸化減少而加重大腦缺血，激活STAT3增加了缺血心肌的存活。STAT3缺陷大鼠表現(xiàn)出腦梗死面積增大以及

7、心肌缺血再灌注損傷后心臟功能的降低。JAK1/STAT3激活有助于神經(jīng)保護(hù)。STAT1基因敲除或STAT1抑制后，TNF-a、IL-6、IL-β表達(dá)減少，缺血再灌注損傷減少，細(xì)胞耐缺血能力增加。SCI后STAT1時(shí)間及空間的改變以及SCI后STAT1的作用目前仍未完全闡明，本實(shí)驗(yàn)采用免疫印跡分析檢測(cè)脊髓損傷后脊髓組織中不同時(shí)間點(diǎn)JAK1與STAT1的表達(dá)變化，并且采用STAT1抑制劑及STAT1 siRNA干預(yù)方式，觀察其對(duì)損傷脊髓組織

8、中不同時(shí)間點(diǎn)JAK1與STAT1活性的影響，各種炎癥因子表達(dá)的變化，行為學(xué)評(píng)分，脊髓脫髓鞘，細(xì)胞凋亡等探討STAT1抑制在脊髓損傷早期治療中的作用，為臨床治療提供理論依據(jù)。
　　目的:
　　SCI后存在時(shí)間依賴性的JAK/STAT信號(hào)通路的激活，脊髓損傷與JAK/STAT表達(dá)變化具有相關(guān)性，因此對(duì)脊髓損傷后JAK/STAT通路的的研究具有重要意義，本研究應(yīng)用大鼠急性脊髓損傷模型，采用免疫印跡分析檢測(cè)脊髓損傷后脊髓組織中不同時(shí)

9、間點(diǎn)JAK1與STAT1的表達(dá)變化，并且采用STAT1抑制劑及STAT1siRNA干預(yù)方式，腹腔注射STAT1抑制劑或STAT1siRNA，觀察其對(duì)損傷脊髓組織中不同時(shí)間點(diǎn)JAK1與STAT1活性的影響，各種炎癥因子表達(dá)的變化、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)、行為學(xué)評(píng)分、脊髓脫髓鞘、組織學(xué)分析等，探討STAT1阻斷或抑制在脊髓損傷早期的作用，為臨床治療提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　1.對(duì)大鼠進(jìn)行脊髓損傷模型建立，在手術(shù)后隨機(jī)分為Sham

10、組、SCI組、STAT1inhibitor組，采取分級(jí)運(yùn)動(dòng)評(píng)分檢測(cè)運(yùn)動(dòng)功能，HE檢測(cè)脊髓損傷程度。
　　2.對(duì)大鼠進(jìn)行脊髓損傷模型建立，在手術(shù)后隨機(jī)分為Sham組、SCI組、STAT1inhibitor組，應(yīng)用Western blot及免疫熒光法檢測(cè)JAK1/STAT1磷酸化水平;ELISA檢測(cè)炎癥因子變化;TUNEL染色進(jìn)行脊髓組織形態(tài)學(xué)研究。
　　3.對(duì)大鼠進(jìn)行脊髓損傷模型建立，在手術(shù)后隨機(jī)分為Sham組、SCI+con

11、trolsiRNA組、SCI+STAT1siRNA組。采取分級(jí)運(yùn)動(dòng)障礙檢測(cè)，HE檢測(cè)脊髓損傷程度;ELISA檢測(cè)炎癥因子變化;尼氏染色檢測(cè)脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元情況。Western blot檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況及脊髓脫髓鞘情況。
　　結(jié)果:
　　1.病理切片證實(shí)，脊髓發(fā)生撞擊性損傷，術(shù)后大鼠雙側(cè)后肢運(yùn)動(dòng)能力喪失，大鼠脊髓損傷模型建立成功。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，兩組的運(yùn)動(dòng)功能得到了一定的恢復(fù)，就SCI組與STAT1inhibitor組比較，

12、STAT1inhibitor組的運(yùn)動(dòng)功能在術(shù)后每個(gè)檢測(cè)點(diǎn)均高于SCI組。
　　2.CBS評(píng)分檢測(cè)結(jié)果與BBB評(píng)分相類似，兩組均隨時(shí)間的延長(zhǎng)，綜合功能得到了一定的恢復(fù)，就SCI組與STAT1inhibitor組比較，STAT1inhibitor組的肢體感覺(jué)與神經(jīng)反射功能在術(shù)后每個(gè)檢測(cè)點(diǎn)均高于SCI組。
　　3.發(fā)現(xiàn)SCI后，p-JAK1與p-STAT1水平隨著時(shí)間推移，表達(dá)量逐漸增高，并在48小時(shí)到達(dá)了高峰。而JAK1與STA

13、T1的總蛋白水平則變化不大。免疫熒光方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果也與Western blot相同。
　　4.發(fā)現(xiàn)SCI組與Sham組比較，髓過(guò)氧化物酶(MPO)濃度有顯著的升高，而在STAT1inhibitor組的MPO濃度較SCI組有明顯的降低。并且對(duì)促炎癥細(xì)胞因子單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）表達(dá)檢測(cè)及誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(iNOS)的表達(dá)也與MPO有類似的變化。
　　5.對(duì)大鼠脊髓損傷的組織形態(tài)學(xué)檢測(cè)，SCI組能夠看到有明顯

14、的白質(zhì)水腫現(xiàn)象，而進(jìn)行了STAT1siRNA干預(yù)后，能夠看到組織形態(tài)上有明顯的好轉(zhuǎn)，白質(zhì)水腫明顯減少。
　　6.TUNEL法檢測(cè)能夠發(fā)現(xiàn)SCI組凋亡陽(yáng)性細(xì)胞較Sham組比較有顯著的升高，STAT1抑制劑的干預(yù)后能夠明顯減少脊髓組織中細(xì)胞的凋亡。
　　7.發(fā)現(xiàn)STAT1siRNA干預(yù)能夠明顯降低SCI所引起的TNF-α、IL-1β及IL-6的濃度升高的情況，而IL-10的濃度變化則與上述幾個(gè)細(xì)胞因子相反。
　　8.通過(guò)W

15、estern blot檢測(cè)，能夠看到STAT1siRNA干預(yù)能夠顯著降低STAT1蛋白的表達(dá)，SCI+controlsiRNA組的核因子-κ Bp65(NF-κ Bp65)蛋白表達(dá)顯著升高，而加入了STAT1siRNA后NF-κ Bp65蛋白的表達(dá)又能夠被明顯遏制。SCI+controlsiRNA組的Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低，而加入了STAT1siRNA后，Bcl-2蛋白表達(dá)水平有了明顯的升高。而Bax蛋白表達(dá)則相反。
　　9.

16、通過(guò)尼氏實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SCI組脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)量丟失明顯，而STAT1siRNA干預(yù)后運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的數(shù)量丟失明顯減少。
　　10.通過(guò)Western blot檢測(cè)，Sham組髓鞘相關(guān)抑制因子MAG及Nogo-A的表達(dá)水平較低，而在SCI+controlsiRNA組則有明顯的升高，經(jīng)過(guò)STAT1siRNA干預(yù)后，上述因子的表達(dá)有了明顯的下降。
　　結(jié)論:
　　1.脊髓損傷后大鼠運(yùn)動(dòng)能力受損，JAK1/STAT1信號(hào)通路參與了