卡泊三醇對銀屑病患者JAK-STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的影響.pdf

1、研究背景:銀屑?。≒soriasis）是最常見的慢性炎癥性增生性皮膚病之一，病情頑固，易復(fù)發(fā)，且可造成全身系統(tǒng)損害。其主要的組織病理學(xué)改變?yōu)榻琴|(zhì)形成細(xì)胞異常增生、角化不全、角化過度、血管生成和炎性細(xì)胞浸潤。其病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，也無特效治療藥物，目前尚無有效根治方法，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，甚至生存周期，是目前國內(nèi)外重點(diǎn)關(guān)注的疾病之一。研究多顯示免疫平衡失調(diào)和（或）表皮角質(zhì)形成細(xì)胞增生異常與其發(fā)病密切相關(guān)，其中細(xì)胞因子對角質(zhì)形成

2、細(xì)胞的增生和分化、病理和細(xì)胞動(dòng)力學(xué)均有一定作用。目前已證實(shí)T細(xì)胞活化及T細(xì)胞一角質(zhì)形成細(xì)胞調(diào)節(jié)水平異常等在銀屑病發(fā)病機(jī)制中起著非常重要的作用，且其發(fā)病過程與多種炎癥細(xì)胞、細(xì)胞因子及生長因子有關(guān)[1]。
　　 近年來JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與銀屑病的關(guān)系受到越來越多的關(guān)注，大量的研究工作表明JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是細(xì)胞因子信息內(nèi)傳最重要的一條通道?；罨腡細(xì)胞分泌的多種細(xì)胞因子與細(xì)胞表面相應(yīng)受體結(jié)合，通過JAK/STAT

3、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路將胞外信號(hào)傳遞至胞核內(nèi)，調(diào)節(jié)角質(zhì)形成細(xì)胞等細(xì)胞的增殖和分化，從而在銀屑病的發(fā)病過程中起到重要的作用。但STAT轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的準(zhǔn)確作用尚未完全清楚。
　　 國內(nèi)外大量研究結(jié)果表明在銀屑病皮損區(qū)，激活的T細(xì)胞可以產(chǎn)生一系列的細(xì)胞因子，而這些細(xì)胞因子與角質(zhì)形成細(xì)胞表面相應(yīng)受體結(jié)合后，可能引起角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)角蛋白表達(dá)模式的改變[1,2]。且研究發(fā)現(xiàn)K17蛋白(Keratin17，K17)在銀屑病皮損中高表達(dá)，但在正常皮膚都未見表

4、達(dá)，并已被認(rèn)為是銀屑病的標(biāo)志物之一。其中細(xì)胞因子IFN-γ可激活STAT1，誘導(dǎo)表皮基底層以上部分角質(zhì)形成細(xì)胞表達(dá)角蛋白K17[3]。而史曉蔚[4]等研究也表明角質(zhì)形成細(xì)胞中IL-17A可以通過STAT1和STAT3途徑劑量依賴性的上調(diào)K17的表達(dá)。目前多數(shù)研究已表明，銀屑病患者皮損的表皮中下層細(xì)胞的胞漿及胞核中高表達(dá)STAT3蛋白，其在血液中的表達(dá)也顯著升高，并且與病情的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[5]。同時(shí)，有研究表明STAT3的異?；罨梢?/p>

5、促進(jìn)細(xì)胞分化增殖、抑制細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致細(xì)胞增殖異常和（或）惡性轉(zhuǎn)化，從而導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生。提示STAT3在銀屑病發(fā)病中起重要作用。因此，STAT1和STAT3在角質(zhì)形成細(xì)胞異常增殖的銀屑病患者中是否存在高表達(dá)，并協(xié)同導(dǎo)致銀屑病發(fā)病值得深入研究。
　　 近來，已清楚至少有三類不同的抑制蛋白與細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的負(fù)調(diào)節(jié)有關(guān)。其中SOCS家族中許多成員是大多數(shù)細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，參與許多炎癥性疾病免疫學(xué)發(fā)病[6]。其

6、中SOCS家族中的SOCS1，SOCS3在銀屑病的發(fā)病過程中的作用越來越受到關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)SOCS1是IFN-信號(hào)活動(dòng)的負(fù)性反饋調(diào)節(jié)因子，SOCS-3可以抑制IL-2引起的炎癥反應(yīng)，而IFN-、IL-2為角質(zhì)形成細(xì)胞最強(qiáng)大的炎癥前細(xì)胞因子[7，8]，IFN-、IL-2通過誘導(dǎo)JAK-STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，形成角質(zhì)形成細(xì)胞免疫炎性反應(yīng)。盡管多數(shù)研究證實(shí)了JAK/STAT及其負(fù)性調(diào)控因子在銀屑病發(fā)病中的重要作用，然而其具體的作用機(jī)制尚未完全

7、清楚，需要進(jìn)一步深入探討。
　　 卡泊三醇是1，25(OH)2D3的類似物，臨床研究證實(shí)1，25(OH)2D3及其類似物治療銀屑病療效確切。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，其與骨化三醇受體有較強(qiáng)的親合力，可減少銀屑病患者的IL-6含量和分布，以及活化的表皮T淋巴細(xì)胞數(shù)。從而使銀屑病皮損的增生和分化異常得以糾正。同時(shí)，也發(fā)現(xiàn)CPT的抗增殖效應(yīng)與pRB的磷酸化有關(guān)，去磷酸化的pRB與UE2F等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合后，可使多種細(xì)胞周期調(diào)控蛋白和正性轉(zhuǎn)錄因子（如

8、CyclinD1、CDK4、C-Myc）的表達(dá)降低，同時(shí)，CPT可促使TGF-β1的合成增加，而TGF-β1可以抑制CDK4等的表達(dá)。
　　 綜合以上這些研究結(jié)果，JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在銀屑病發(fā)病中作用機(jī)制及卡泊三醇對其的影響值得深入研究，是否可以提出卡泊三醇可能直接作用于JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，從而達(dá)到治療銀屑病的目的呢？為了解決上述問題，本研究以人角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT細(xì)胞株為研究對象，利用RNA干擾技術(shù)，設(shè)計(jì)

9、針對STAT1/STAT3的特異性siRNA，再將沉默序列轉(zhuǎn)染至HaCaT細(xì)胞中，分別沉默STAT1/STAT3基因。然后，采用Q-PCR和Western-blot檢測沉默后STAT1/STAT3沉默后的效果，篩選出最佳沉默序列，以期進(jìn)一步探討銀屑病的發(fā)病機(jī)制及卡泊三醇治療銀屑病的作用機(jī)制。
　　 目的:
　　 1.通過RNA干擾技術(shù)建立STAT3/STAT1低表達(dá)的角質(zhì)形成細(xì)胞，研究STAT3/STAT1的表達(dá)水平及負(fù)

10、性調(diào)節(jié)因子(SOCS1/SOCS3)對銀屑病的生物學(xué)影響及基因調(diào)控機(jī)制。
　　 2.探討卡泊三醇對JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的影響，從而確認(rèn)卡泊三醇治療銀屑病的可能作用靶點(diǎn)及機(jī)制。
　　 方法:
　　 1.使用DMEM/10％FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)HaCaT細(xì)胞。
　　 2.分別用0.1nM、1nM、10nM、100nM、1uM、10uM濃度的卡泊三醇處理HaCaT細(xì)胞，不施加任何干預(yù)HaCaT細(xì)胞作為空白對

11、照。分別于培養(yǎng)0h，12h，24h，48h，72h后收獲細(xì)胞，利用MTS觀察不同濃度的卡泊三醇處理后的HaCaT細(xì)胞在增殖情況，得出最佳OD值，篩選出卡泊三醇最佳抑制HaCaT細(xì)胞增殖的濃度，觀察是否呈劑量依賴關(guān)系。
　　 3.運(yùn)用Q-PCR和Western-blot檢測空白組及最佳卡泊三醇抑制處理后的HaCaT細(xì)胞的STAT1、STAT3、P-STAT1、P-STAT1、SOCS1、SOCS3基因及蛋白變化情況。
　　

12、 4.siRNA-STAT1/siRNA-STAT3的構(gòu)建和轉(zhuǎn)染:①從基因數(shù)據(jù)庫(如www.ncbi.nlm.nih.gov)搜索人的STAT3mRNA全基因序列，利用BLAST軟件進(jìn)行同源性分析。②將對比好的STAT1/STAT3mRNA全基因序列作為模版，根據(jù)siRNA的設(shè)計(jì)原則，分別設(shè)計(jì)三對siRNA。③按照設(shè)計(jì)的序列，合成siRNA-STAT1-001/siRNA-STAT3-001、siRNA-STAT1-002/siRNA-

13、STAT3-002、siRNA-STAT1-003/siRNA-STAT3-003，同時(shí)設(shè)立陰性對照組④采用不同濃度的Lipo2000轉(zhuǎn)染試劑將制備好的上述siRNA轉(zhuǎn)導(dǎo)至HaCaT細(xì)胞中。
　　 5.沉默效果檢測:采用Q-PCR和Western-blot檢測RNAi沉默后STAT1、STAT3基因及蛋白表達(dá)情況，并篩選出最佳沉默序列。
　　 6.擴(kuò)大培養(yǎng)成功沉默的HaCaT細(xì)胞株，通過MTS、Q-PCR和Western

14、-blot等方法檢測表達(dá)分別沉默STAT1/STAT3基因后，對HaCaT細(xì)胞株的增殖影響及其對JAK/STAT號(hào)通路中相關(guān)基因的影響。
　　 7.藥物干預(yù):分別運(yùn)用上述篩選的最佳siRNA-STAT3/siRNA-STAT3，分別沉默STAT1、STAT3，結(jié)合1uM濃度的卡泊三醇處理24h、48、72h后，運(yùn)用定Q-PCR和Western-blot檢測STAT1、STAT3、P-STAT1、P-STAT1、SOCS1、SOC

15、S3基因及蛋白變化情況。
　　 8.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:結(jié)果采用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，細(xì)胞增殖等單因素均數(shù)比較若方差齊使用One-Way ANOVA方差分析， LSD方法進(jìn)行多重比較;若方差不齊則使用采用近似F檢驗(yàn)（Welch方法）代替方差分析后采用Dunnett T3方法進(jìn)行多重比較;MTS多因素均數(shù)比較使用析因設(shè)計(jì)方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì);計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:

16、>　　 1.分別以0.1nM，1nM，10nM，102nM，103nM，104nM濃度的卡泊三醇處理HaCaT細(xì)胞株后，用MTS法檢測卡泊三醇對HaCaT細(xì)胞細(xì)胞增殖影響。其中不同濃度細(xì)胞間增值率的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=29.521，P＜0.001);12h、24h、48h和72h的OD值進(jìn)行析因設(shè)計(jì)的方差分析，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2005.857，P＜0.001);時(shí)間和細(xì)胞之間有交互效應(yīng)(F=3.406，P＜0.001)。其12

17、h、24h、48h和72h時(shí)組間的OD值均有明顯差異（均P＜0.001）。結(jié)合多重比較結(jié)果顯示:1nM，10nM，102nM，103nM，104nM濃度對細(xì)胞增值影響的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義((P＞0.05)，而0、0.1nM和以上各組間差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。綜上所述，在后續(xù)試驗(yàn)中我們將采用10nM卡泊三醇進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。并在此濃度下運(yùn)用Q-PCR和Western-blot檢測STAT1、STAT3、P-STAT1、P-STAT1

18、、SOCS1、SOCS3基因和蛋白水平的表達(dá)均下降。
　　 2.采用不同濃度的上述siRNA干擾序列轉(zhuǎn)染至HaCaT細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染后24h后于熒光顯微鏡下觀察到大量綠色熒光。采用Q-PCR和Western-blot檢測RNAi沉默后STAT1、STAT3基因及蛋白表達(dá)情況，證實(shí)STAT1/STAT3在HaCaT細(xì)胞株中被沉默。并且篩選出 siRNA-STAT1-003-50um，siRNA-STAT3-001-50um序列沉默的效

19、果最好。
　　 3.分別將siRNA-STAT1/siRNA-STAT3成功轉(zhuǎn)染至HaCaT細(xì)胞后，將細(xì)胞分為8個(gè)組:A:空白組;B.lipo2000; C.NCsiRNA; D.10nM卡波三醇;E.STAT1siRNA; F.STAT3siRNA; G.STAT1 siRNA+10nM卡泊三醇;H.STAT3siRNA+10nM卡泊三醇的。其中A、B、C組中STAT1、STAT3、P-STAT1、P-STAT1、SOCS1、

20、SOCS3在基因和蛋白水平的表達(dá)無明顯差異(P＞0.05)。D、E、F、G、H中的STAT1、STAT3、P-STAT1、P-STAT1、SOCS1、SOCS3的基因和蛋白水平的表達(dá)較述三組均下降。發(fā)現(xiàn)單純卡泊三醇處理組和SiRNA-STAT1/SiRNA-STAT3組的JAK/STAT通路的相關(guān)因子的基因及蛋白水平都下降，各組之間相差不明顯，而且卡泊三醇+siRNA-STAT1-003（G組）與siRNA-STAT1-003（E組）S

21、TAT1/p-STAT1基因、蛋白的表達(dá)水平無明顯差異?？ú慈?siRNA-STAT3-001（H組）與siRNA-STAT3-001（F組）STAT3/p-STAT3基因、蛋白的表達(dá)水平無明顯差異。
　　 4.用MTS法檢測上述八組的HaCaT細(xì)胞細(xì)胞增殖情況。其中不同組細(xì)胞間增值率的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=112.243，P＜0.001);0h、24h、48h和72h的OD值進(jìn)行析因設(shè)計(jì)的方差分析，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=31

22、69.76，P＜0.001):時(shí)間和分組之間有交互效應(yīng)(F=32.211，P＜0.001)，其中0h時(shí)8組間的OD值無明顯差異(P=0.922)，24h、48h和72h時(shí)均有明顯差異（均P＜0.001）。結(jié)合多重比較結(jié)果顯示:其中A、B、C三組對細(xì)胞增值影響的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，而D、E、F、G、H五個(gè)干擾組和以上各組間差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)，并且D、E、F、G、H各組間對細(xì)胞的增殖影響的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞

23、0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.運(yùn)用卡泊三醇處理HaCaT細(xì)胞株后，STATI/STAT3及其負(fù)性調(diào)節(jié)因子(SOCS1、SOCS3)的基因和蛋白表達(dá)下調(diào)，并且HaCaT細(xì)胞增殖也受到抑制。進(jìn)一步運(yùn)用RNAi分別沉默STAT1/STAT3后，各組中STAT1/STAT3及其負(fù)性調(diào)節(jié)因子(SOCS1、SOCS3)的基因和蛋白表達(dá)同樣下調(diào)，從而可能提示了卡泊三醇可能通過JAT/STAT信號(hào)通路影響HaCaT細(xì)胞的分化、增

24、殖。由此推測，JAT/STAT通路是銀屑病發(fā)病的一個(gè)潛在關(guān)鍵點(diǎn)，通過沉默STAT1/STAT3，下調(diào)其表達(dá)，可成為靶向治療銀屑病的一種新方法。
　　 2.卡泊三醇處理組和siRNA-STAT1-003、siRNA-STAT3-001組的STAT1、STAT3、P-STAT1、P-STAT1、SOCS1、SOCS3的基因及蛋白水平都下降，相差不明顯，說明卡泊三醇可能通過抑制JAK/STAT通路的激活發(fā)揮治療作用。而且卡泊三醇+si

25、RNA-STAT1-003（G組）與siRNA-STAT1-003（E組）STAT1/p-STAT1基因、蛋白的表達(dá)水平無明顯差異，卡泊三醇+siRNA-STAT3-001（H組）與siRNA-STAT3-001（F組）STAT3/p-STAT3基因、蛋白的表達(dá)水平無明顯差異。進(jìn)一步說明卡泊三醇可能通過JAK/STAT途徑下調(diào)STAT1和STAT3的表達(dá)，從而抑制角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，STAT1與STAT3兩者之間可能存在