銀屑病患者JAK-STAT信號(hào)傳導(dǎo)通路基因表達(dá)的研究.pdf

1、研究背景:銀屑病是一種常見的慢性、復(fù)發(fā)性、炎癥性、免疫紊亂性疾病，全世界銀屑病的患病率為1～4％左右[1,2]。本病主要侵犯青壯年，臨床上分為尋常型、膿皰型、關(guān)節(jié)病型及紅皮病型銀屑病4種類型，其中尋常型銀屑病是臨床最多見的類型，臨床表現(xiàn)主要為紅色丘疹、斑塊，表面覆蓋有程度不等的白色鱗屑，除皮損外，患者尚可出現(xiàn)代謝綜合征的相關(guān)表現(xiàn)，近年來大量的流行病學(xué)調(diào)查研究表明銀屑病，尤其是關(guān)節(jié)型銀屑病與高同型半胱氨酸血癥、高脂血癥、動(dòng)脈粥樣硬化、肥胖

2、癥和糖尿病等代謝性疾病有關(guān)，從而嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，給患者帶來極大的身體和心理上的痛苦。由于該病反復(fù)發(fā)作，常需反復(fù)治療，因而給患者及其家庭帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。故其對(duì)患者的身體健康和精神影響甚大，是當(dāng)前皮膚科領(lǐng)域內(nèi)重點(diǎn)研究的疾病之一，對(duì)銀屑病的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行深入的探討意義重大。
　　 銀屑病的主要病理改變?yōu)楸砥そ腔^度伴角化不全，真皮乳頭毛細(xì)血管增生、擴(kuò)張，炎細(xì)胞顯著浸潤(rùn)。其確切病因和發(fā)病機(jī)制尚未清楚，目前認(rèn)為，銀屑病是遺傳因素

3、與環(huán)境因素等多種因素相互作用的多基因遺傳病，多數(shù)研究表明銀屑病的發(fā)生與免疫功能紊亂有一定的關(guān)系，免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞的增生和分化、毛細(xì)血管增生、擴(kuò)張均有一定的作用。因此，對(duì)其進(jìn)行分子免疫學(xué)的研究在疾病的診斷、判斷病期、預(yù)見轉(zhuǎn)歸、尋找新的免疫治療藥物方面有著十分重要的應(yīng)用價(jià)值和學(xué)術(shù)價(jià)值。目前研究表明有40多種激素、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和生物活性物質(zhì)參與調(diào)節(jié)角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖和分化，數(shù)種信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)參與了這一調(diào)節(jié)過程。
　　

4、 目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為銀屑病是一種T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病。國外研究結(jié)果表明在銀屑病皮損區(qū)，激活的T細(xì)胞產(chǎn)生一系列細(xì)胞因子，包括IFN-γ、IL-1、6、8及TNF等，這些細(xì)胞因子與角質(zhì)形成細(xì)胞表而相應(yīng)受體結(jié)合后，可能引起角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)角蛋白表達(dá)模式的改變。Janus激酶(JAKs)是一種蛋白酪氨酸激酶，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(STATs)是JAKs的直接底物，能將信號(hào)傳遞到核內(nèi)，調(diào)節(jié)特定基因的表達(dá)，二者構(gòu)成JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

5、。在角質(zhì)形成細(xì)胞中， JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在銀屑病的發(fā)病中起重要作用，而STAT轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的準(zhǔn)確作用尚不完全清楚，似乎有抗增殖和促分化的作用，但不同類型的作用有待進(jìn)一步明確。
　　 JAK/STAT是一條是繼Ras途徑之后出現(xiàn)的又一重要的細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。該通路的激活是多數(shù)細(xì)胞因子發(fā)揮其生物效應(yīng)最普遍且最重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路。細(xì)胞因子能與靶細(xì)胞上相應(yīng)的受體相結(jié)合，通過JAK/STAT通路將信號(hào)由細(xì)胞膜傳至細(xì)胞質(zhì)并最

6、終傳至細(xì)胞核，而發(fā)揮多種生物學(xué)效應(yīng)。研究表明，JAK/STAT途徑參與人體內(nèi)生理和病理反應(yīng)，與多種疾病的發(fā)病及防治密切相關(guān)。細(xì)胞因子激活JAK，后者磷酸化STAT，經(jīng)磷酸化而活化的STAT移位到細(xì)胞核，與特定的DNA元件結(jié)合，發(fā)揮其生物活性。STAT蛋白是一類胞漿蛋白，參與多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的信號(hào)傳導(dǎo)。到目前為止，在哺乳動(dòng)物中已分離、克隆出7種STATs基因和蛋白:STAT1，STAT2，STAT3，STAT4，STAT5a，STA

7、T5b和STAT6，其中STAT1和STAT2的組織分布最廣?，F(xiàn)證實(shí)STAT1、STAT3的異常活化可以促進(jìn)細(xì)胞的分化增殖，抑制細(xì)胞的凋亡，從而導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生[3-5]1997年發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制物(SOCS)被認(rèn)為是JAK/STAT信號(hào)系統(tǒng)的主要負(fù)調(diào)節(jié)機(jī)制。其中SOCS1、SOCS3是最重要、最主要的細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制物，也是目前SOCS家族中研究比較清楚的。SOCS蛋白是多數(shù)細(xì)胞因子受體信號(hào)傳導(dǎo)的重要調(diào)節(jié)劑，它們通過負(fù)

8、反饋方式調(diào)節(jié)細(xì)胞因子啟動(dòng)的JAK/STAT信號(hào)傳導(dǎo)通路。其作用機(jī)制包括:與JAK結(jié)合而抑制其激酶活性，競(jìng)爭(zhēng)性抑制STAT與活化受體的結(jié)合而抑制STAT的激活，以及介導(dǎo)信號(hào)蛋白依賴蛋白酶體的降解過程[4，5]。
　　 銀屑病是一種與免疫功能紊亂有關(guān)的疾病，異常激活的T細(xì)胞產(chǎn)生一系列細(xì)胞因子，后者可能引起角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)角蛋白表達(dá)模式的改變。其中，IFN-γ與角蛋白K17表達(dá)的關(guān)系已明確，IFN-γ可激活STAT1，多個(gè)STAT結(jié)合到

9、K17基因啟動(dòng)子(promoter)，誘導(dǎo)表皮基底層以上部分角質(zhì)形成細(xì)胞表達(dá)角蛋白K17，另外有許多因子（如IL-3、粒細(xì)胞—巨噬細(xì)胞集落刺激因子、IL-6等）通過一個(gè)共同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制參與了這一過程的調(diào)控。細(xì)胞因子類受體本身缺乏酪氨酸激酶活性，其信號(hào)傳遞必須借助細(xì)胞內(nèi)JAKs家族完成，后者又通過激活STATs，影響最終的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。此外，研究顯示在銀屑病發(fā)病過程中，銀屑病皮損浸潤(rùn)的T淋巴細(xì)胞分泌的IFN-γ，其本身的抗增殖和誘導(dǎo)分化

10、作用對(duì)銀屑病皮損的角質(zhì)形成細(xì)胞不敏感是因?yàn)镮FN-γ受體信號(hào)途徑的異常。IFN-γ受體(IFN-γ R)信號(hào)途徑中STAT1的磷酸化影響到最終的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。病變的角質(zhì)形成細(xì)胞中STAT1活性降低，影響到受其調(diào)節(jié)的IFN-γ調(diào)節(jié)因子1的活性，使異常增殖的角質(zhì)形成細(xì)胞對(duì)IFN-γ作用不敏感，造成銀屑病表皮生長(zhǎng)失控[6-13]。基于上述研究結(jié)果，JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在銀屑病發(fā)病中作用值得研究。
　　 研究目的:
　　

11、 1、收集銀屑病患者皮損區(qū)和非皮損區(qū)的部分組織，并從該組織中分離出角質(zhì)形成細(xì)胞。
　　 2、用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法分別檢測(cè)各皮損區(qū)和非皮損區(qū)角質(zhì)形成細(xì)胞中STAT1、STAT3、SOCS1、SOCS3基因mRNA的表達(dá)。
　　 3、探討角質(zhì)形成細(xì)胞中STAT1、STAT3、SOCS1和SOCS3基因的表達(dá)與銀屑病發(fā)病的關(guān)系，推測(cè)JAK/STAT信號(hào)傳導(dǎo)途徑及其負(fù)性調(diào)節(jié)因子(SOCS)在銀屑病發(fā)病中的作用及意義。
　

12、　 4、探討銀屑病STAT與其負(fù)性調(diào)節(jié)因子SOCS之間的相互關(guān)系，進(jìn)一步研究銀屑病的發(fā)病機(jī)制。
　　 研究方法:
　　 1、研究對(duì)象:具有銀屑病典型皮損并經(jīng)病理確診，臨床上處于進(jìn)展期即:新皮疹不斷出現(xiàn)，皮疹不斷擴(kuò)大，顏色鮮紅，鱗屑較薄，炎癥明顯，周圍有炎性紅暈，癢感較顯著;取材前1個(gè)月內(nèi)未系統(tǒng)使用糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑、維A酸類藥物及其他治療藥物，1個(gè)月內(nèi)未外用治療銀屑病的藥物;無其他系統(tǒng)疾患。符合以上條件的患者共10

13、例。
　　 2、采用手術(shù)取材法收集上述銀屑病患者皮損區(qū)和非皮損區(qū)部分組織，分別去除皮下組織、留下表皮層和真皮層。
　　 3、將標(biāo)本剪成8mm×3mm大小， PBS清洗3次，加入1.6 U/mL dispase中4℃消化過夜，第2天剝離出表皮并將其保存在凍存管中備用以抽取RNA。
　　 4、抽取組織總RNA，并以紫外分光光度計(jì)檢測(cè)各RNA樣本的OD260/280值，判定RNA的純度（即分別在波長(zhǎng)260nm與280n

14、m下測(cè)定RNA樣本的吸光度A260和A280，并計(jì)算A260/A280比值，A260/A280≥1.8為純度合格），并計(jì)算RNA濃度。另取適量RNA在1％瓊脂糖凝膠和1×TAE電泳液中電泳(電壓100V)20min，通過凝膠成像分析儀觀察RNA的電泳圖像，如果見較為清晰的28S與18S條帶，說明RNA樣本質(zhì)量較好。符合上述條件的RNA置-80℃冰箱備用。
　　 5、引物設(shè)計(jì)及合成:檢索NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫，所設(shè)計(jì)引物分

15、別針對(duì)不同的外顯子，以三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參對(duì)照的校準(zhǔn)基因。應(yīng)用Primer Premier5軟件設(shè)計(jì)STAT1、STAT3、SOCS1、SOCS3和GAPDH的PCR引物。
　　 6、逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA將提取的總RNA按TaKaRa PrimeScriptⅡ lst StrandcDNA Synthesis Kit(D6210A)試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。
　　 7、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng):P

16、CR反應(yīng)體系總體積20μL，包括cDNA2.0μL, dH206.4μL,SYBR(@)Premix Ex TaqTM(2×)10.0μL,10μmol/L上下游引物各0.8μL。在CFX96熒光定量PCR儀上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。各基因每個(gè)標(biāo)本做3個(gè)復(fù)孔，擴(kuò)增條件采用三步法:95℃，10min預(yù)變性，1個(gè)循環(huán);95℃，10s，變性，60℃，20s，退火，72℃，30s，延伸，共44循環(huán)。計(jì)算各標(biāo)本平均Ct值，以GAPDH作為內(nèi)參，將

17、STAT1、STAT3、SOCS1、SOCS3 Ct值減去GAPDH Ct值作為ΔCt值。
　　 8、采用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以(x)±s表示。作方差齊性分析和t檢驗(yàn)。變量間的相關(guān)關(guān)系用Pearson相關(guān)分析，所有檢驗(yàn)以P＜0.05為差異為統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1、銀屑病皮損區(qū)組和非皮損區(qū)組候選基因mRNA的表達(dá)水平:銀屑病患者皮損區(qū)組角質(zhì)形成細(xì)胞STAT1、STAT3、SOCS

18、1、SOCS3基因mRNA的表達(dá)水平顯著高于非皮損區(qū)組，均P＜0.01。
　　 2、角質(zhì)形成細(xì)胞STAT1、STAT3基因mRNA的表達(dá)與SOCS1、SOCS3基因mRNA的表達(dá)的相關(guān)性:銀屑病患者角質(zhì)形成細(xì)胞STAT1 mRNA的表達(dá)水平ΔCt值與SOCS1、SOCS3 mRNA的表達(dá)水平ΔCt值呈顯著的正相關(guān)(r=0.787、0.843，均P＜0.01);而角質(zhì)形成細(xì)胞STAT3 mRNA的表達(dá)水平ΔCt值與SOCS1、SO

19、CS3mRNA的表達(dá)水平ΔCt值也呈顯著的正相關(guān)（r=0.843、0.829，均P＜0.01）。
　　 結(jié)論:
　　 1、銀屑病患者皮損區(qū)組角質(zhì)形成細(xì)胞STAT1、STAT3基因mRNA的表達(dá)水平顯著高于非皮損區(qū)組，提示Jak/STAT信號(hào)傳導(dǎo)通路可能參與銀屑病的發(fā)病。推測(cè)Th1細(xì)胞分泌的這些細(xì)胞因子與角質(zhì)形成細(xì)胞膜上相應(yīng)的受體結(jié)合后活化Jak，進(jìn)而磷酸化其下游信號(hào)蛋白分子STAT，后者識(shí)別并結(jié)合靶基因DNA特異的反應(yīng)元

20、件，調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)銀屑病皮損的形成。
　　 2、銀屑病患者皮損區(qū)組角質(zhì)形成細(xì)胞SOCS1、SOCS3基因mRNA的表達(dá)水平顯著高于非皮損區(qū)組，且銀屑病患者角質(zhì)形成細(xì)胞STAT1、STAT3 mRNA的表達(dá)水平分別與SOCS1和SOCS3 mRNA的表達(dá)水平呈顯著的正相關(guān)，推測(cè)細(xì)胞因子激活Jak/STAT信號(hào)傳導(dǎo)通路、觸發(fā)銀屑病皮損發(fā)生發(fā)展的同時(shí)，也誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞生成SOCS1、SOCS3并抑制細(xì)胞因子進(jìn)行Jak/S