中性粒細胞及相關信號通路JAK-STAT在角膜基質創(chuàng)傷愈合中的作用.pdf

1、目的： 通過建立小鼠十字形角膜穿通傷的動物模型，清除小鼠血循環(huán)中的中性粒細胞，研究中性粒細胞對小鼠十字形角膜穿通傷早期炎癥反應及角膜基質細胞活躍性的影響；初步探討炎癥信號通路JAK-STAT在角膜基質損傷早期的作用。 方法： 小鼠角膜十字形角膜穿通傷動物模型的建立：選用近交系C57小鼠共170只，按照隨機數(shù)字表法，隨機分為四組：正常對照組：11只，不做任何處理；對照組：72只，單純行十字形角膜穿通傷；中性粒細胞減

2、少組：27只，小鼠于十字形角膜穿通傷前1天、當天、傷后1、2、3連續(xù)腹腔注射大鼠抗小鼠中性粒細胞單克隆抗體Gr－110ug；AG490組：60只，小鼠于十字形角膜穿通傷前1天、當天、傷后1、2、3、5、7天結膜下注射1ug/ul的AG490混合液20ul。除正常對照組外，其余三組以20G前房穿刺刀及Vanns剪于角膜中央制作直徑1．2mm十字形穿通傷。采用流式細胞術分析中性粒細胞的清除效率；免疫組化檢測對照組傷后1、3、7天p-STAT

3、3、α-SMA的表達；Western-blot檢測對照組及AG490組傷后1、3、5、7天p-STAT3的表達變化已確定AG490對JAK-STAT信號通路的抑制；裂隙燈顯微鏡觀察各組小鼠傷后1、3、5、7天角膜水腫混濁的情況并進行臨床評分； HE病理切片觀察傷后角膜基質中炎癥細胞浸潤的情況；電鏡超微結構觀察傷后3、7天各組小鼠角膜基質細胞及炎癥細胞活躍程度；Real-time PCR檢測對照組及AG490組傷后1、3、5、7、14、2

4、8天及中性粒細胞減少組傷后1、3、7天IL-6、TNFα、KC、TGFβ mRNA的表達變化 結果： 1、以十字型角膜穿通傷建立的小鼠角膜創(chuàng)傷修復的模型成功率高，損傷范圍適中，可操作性及重復性較好適合角膜基質損傷修復后續(xù)分子機制的研究。 2、10ug大鼠抗小鼠Gr-1單克隆抗體腹腔注射可成功清除小鼠血循環(huán)的中性粒細胞。 3、免疫組化顯示：正常小鼠角膜基質中無p-STAT3、α-SMA的表達；十字形角膜穿通

5、傷后第1天可見p-STAT3的表達，主要位于角膜基質，α-SMA尚未見表達；傷后3、7天角膜基質可見p-STAT3、α-SMA均有陽性著染。 4、Western-blot結果顯示：正常小鼠角膜p-STAT3有微弱的表達；十字形角膜穿通傷后5天p-STAT3出現(xiàn)表達高峰：1ug/ul的AG490混合液20ul結膜下注射可降低p-STAT3的表達。 5、裂隙燈顯微鏡觀察：對照組、中性粒細胞減少組、AG490組傷后1天傷口閉合

6、，前房形成。對照組角膜炎癥反應最重，傷后3-5天出現(xiàn)炎癥反應高峰，角膜水腫混濁范圍>1/2角膜，部分達全角膜，呈毛玻璃樣混濁，混濁邊緣呈向外擴展趨勢。清除中性粒細胞角膜水腫混濁明顯減輕，但炎癥高峰后移出現(xiàn)在第7天。AG490結膜下注射可減輕角膜的炎癥反應，但未推遲炎癥反應的進程，角膜炎癥反應程度介于對照組和中性粒細胞減少組之間，炎癥高峰出現(xiàn)在3-5天。 6、HE病理切片：對照組、中性粒細胞減少組、AG490組，三組傷后1天傷口兩

7、端均有的部分纖維組織聯(lián)結，封閉傷口，傷后3天均可見傷口全層閉合。對照組，傷后3-5天明顯增多，浸潤范圍較彌散。中性粒細胞減少組傷后1、3角膜基質中未見明顯炎癥細胞浸潤，傷后7天傷口邊緣可見少許炎癥細胞。AG490組與中性粒細胞組相比，并未完全阻斷炎癥細胞的浸潤，損傷處仍可見炎癥細胞的浸潤，但與對照組相比角膜基質中炎癥細胞浸潤明顯少。 7、電鏡超微結構觀察：對照組角膜基質中可見活躍的炎癥細胞，角膜基質細胞明顯增生活躍，可見粗面內質

8、網(wǎng)及高爾基體豐富，糖原顆粒富集，細胞突起增多，可見核分裂相；中性粒細胞減少組未見明顯炎癥細胞浸潤，角膜基質細胞輕度增生活躍，粗面內質網(wǎng)及高爾基等細胞器欠發(fā)達；AG490組角膜基質細胞中度增生活躍，可見核分裂相，未見明顯增多的細胞突起，粗面內質網(wǎng)及糖原顆粒輕度增多。偶可見巨噬細胞游走。 8、Real-time PCR結果：對照組傷后1、3、5、7天IL－6、TNFα、KC、TGFβmRNA的表達明顯上調，3-5天出現(xiàn)的表達高峰，1

9、4天基本降低到正常水平；與對照相比中性粒細胞減少組傷后IL-6、TNFα、KC、TGFβ的表達明顯降低，TNFα、KC的表達高峰后移出現(xiàn)在第7天。與對照組相比AG490組IL-6、KC、TGFβ mRNA表達明顯降低，但對TNFα表達影響較小。 結論： 1．十字型角膜穿通傷可以成功建立小鼠角膜穿通傷模型。 2．中性粒細胞減少時，角膜創(chuàng)傷愈合過程的炎癥反應明顯減輕，角膜成纖維細胞的活躍程度降低，但并未影響角膜愈合的