JAK-STAT通路在心肌缺血-再灌注早期損害中的作用研究.pdf

1、體外循環(huán)技術(shù)的使用標(biāo)志著現(xiàn)代心外科的開始，同時(shí)心肌的缺血/再灌注損傷及全身炎癥反應(yīng)一直與體外循環(huán)相伴。體外循環(huán)早期這兩種致病因素互相交織，互相促生，現(xiàn)有預(yù)防治療措施很難對(duì)兩者同時(shí)奏效。細(xì)胞內(nèi)存在多條信號(hào)途徑以行使信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，阻斷某些刺激因素的主要信號(hào)途徑，能有效消除或消減刺激因素誘導(dǎo)的細(xì)胞效應(yīng)。Janu激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子(JAK/STAT)通路是近年來備受關(guān)注的一條細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，參與介導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖分化、炎癥、

2、凋亡等多種生理過程。近兩年來，JAK/STAT通路在心臟疾病發(fā)病機(jī)制中的作用受到重視，心肌肥大、心力衰竭、缺血預(yù)處理誘導(dǎo)的心肌保護(hù)，以及缺血再灌注引起的心功能障礙都與這一相對(duì)簡(jiǎn)單的信號(hào)通路密切相關(guān)。因此，我們推測(cè)JAK/STAT通路與缺血/再灌注及炎性因子所導(dǎo)致體外循環(huán)后心肌損害均有緊密關(guān)聯(lián)。 目的：培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞且制備大鼠離體工作心臟灌注模型，通過觀察JAK/STAT通路與NF-κB、MAPK、PKC、Ca2+信號(hào)途徑在心肌

3、缺血再灌注損傷中作用的差異，探討心肌組織JAK/STAT通路活化規(guī)律以及JAK/STAT通路在缺血再灌注早期心肌損傷中的作用和可能機(jī)制，為臨床實(shí)踐提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：本研究采用乳鼠心肌細(xì)胞和大鼠離體工作心臟灌注模型，分兩部分進(jìn)行。第一部分，培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞，隨機(jī)分為9組，即1)對(duì)照組；2)模擬缺血/再灌注組；3)AG490預(yù)處理組；4)RPM預(yù)處理組；5)AG490+RPM預(yù)處理組；6)PDTC預(yù)處理組；7)SB203580預(yù)

4、處理組；8)SNAP預(yù)處理組；9)S6942預(yù)處理組。預(yù)處理后，細(xì)胞均被缺氧100min，復(fù)氧30min。四唑鹽比色實(shí)驗(yàn)檢測(cè)心肌細(xì)胞活力；采用PI染色與Hoechst33258雙染檢測(cè)細(xì)胞死亡率；測(cè)定培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶(LDH)含量。第二部分，SD大鼠50只，制備離體工作心臟灌注模型，隨機(jī)分為5組。A組為正常對(duì)照；B組停灌30min，復(fù)灌30min;灌注高鉀停搏液；其余各組分別灌注不同的停搏液：C組灌注含AG490的高鉀停搏液；D組灌注

5、含RPM的停搏液；E組灌注含AG490+RPM的停搏液。各組復(fù)灌30min后，監(jiān)測(cè)心率、左室收縮峰壓和舒張末壓，+dp/dtmax以及-dp/dtmax。實(shí)驗(yàn)結(jié)束取心肌組織，部分心肌制病理切片，免疫組化觀察JAK/STAT活化，電鏡下觀察心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變；部分心肌采用Westernblot技術(shù)檢測(cè)JAK/STAT蛋白表達(dá)，RT-PCR檢測(cè)TNF-α、IL-6、iNOS、cPLA2、caspase-3mRNA表達(dá)變化；檢測(cè)心肌組織MDA含

6、量，心肌細(xì)胞凋亡。 結(jié)果 1.在缺氧復(fù)氧刺激下，心肌細(xì)胞活性明顯的降低，細(xì)胞死亡率明顯的升高，LDH漏出增多(P＜0.01)。使用NF-κB、MAPK、PKC、Ca2+和JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制劑后，能夠有效減輕心肌細(xì)胞損傷(P＜0.01)。AG490組與RPM組較其他幾組在減輕心肌細(xì)胞損傷效果上有顯著差異(P＜0.01)。 2.缺血再灌注B組心肌結(jié)構(gòu)損傷，表現(xiàn)為：肌原纖維排列紊亂、松散，Z線模糊，呈波流

7、狀改變；有明顯肌絲溶解，T管和肌漿網(wǎng)擴(kuò)張；線粒體腫脹，有嵴斷裂；細(xì)胞核擠壓變形，核周隙增寬明顯，異染色質(zhì)增多，無邊集。C組與D組心肌結(jié)構(gòu)損傷明顯減輕，且E組心肌結(jié)構(gòu)損傷進(jìn)一步改善。 3.缺血再灌注B組心肌JAK1、JAK2、STAT1、STAT3活化顯著(P＜0.01)；MDA含量明顯增高(P＜0.01)；心肌細(xì)胞凋亡明顯增高(P＜0.01)。C組與D組則顯著降低(P＜0.01)；且E組較C、D組也有明顯降低(P＜0.01)。

8、 4.缺血再灌注B組心肌TNF-α、IL-6、iNOS、cPLA2mRNA表達(dá)明顯增高(P＜0.01)；caspase-3活化增強(qiáng)(P＜0.01)。C組與D組則顯著降低(P＜0.01)；且E組較C、D組也有明顯降低(P＜0.01)。 5.缺血再灌注B組HR、LVPSP、+dp/dtmax及-dp/dtmax較A組顯著降低(P＜0.01)，LVEDP顯著升高(P＜0.01)。C組與D組有明顯改善，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.0

9、1)。E組與C組、D組相比有顯著差異(P＜0.01)。 結(jié)論 1、在缺氧復(fù)氧刺激下，心肌細(xì)胞活性明顯的降低，細(xì)胞死亡率明顯的升高，LDH漏出增多。抑制NF-κB、MAPK、PKC、Ca2+和JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路后，能夠不同程度有效的減輕心肌細(xì)胞損傷。然而在效果上，抑制JAK/STAT通路與抑制其他幾條信號(hào)途徑存在明顯差異，這也初步證明JAK/STAT通路在心肌缺血再灌注損傷中可能占有關(guān)鍵位置。 2、缺血再

10、灌注早期，心肌組織JAK/STAT通路迅速活化并伴有STAT因子的核轉(zhuǎn)位。AG490或RPM能有效抑制JAK/STAT通路活化，減輕心肌結(jié)構(gòu)破壞，減少M(fèi)DA生成，抑制心肌細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步證實(shí)JAK/STAT通路是缺血再灌注早期介導(dǎo)心肌損害的關(guān)鍵信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。 3、缺血再灌注早期，心肌組織TNF-α、IL-6、iNOS、cPLA2等炎性相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，caspase-3活化增強(qiáng)，導(dǎo)致心肌炎性，過氧化，膜磷脂降解，凋亡等多種損害。